由于疫情影响，很多同学没有开学返校，片警实验室的同学们为了学习更多的实验室必备技能，开展了萌新导航系列培训，并在全网同步直播。课堂内容包括各种作图软件、统计软件、文献管理软件等软件的使用，常见数据库的使用，以及常规实验操作等。
本次培训由沈从乐师兄讲解实验室常用质粒载体的构建思路，为了帮助大家更好地学习和复习，我们将提供课程回放和知识点总结供大家学习，祝大家学习愉快！
视频回放
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课堂笔记
01
基础概念
DNA载体可使目的基因在细胞内表达以达到我们的研究目的。
人工改造的质粒是最常用的载体之一，通常具有以下几个特点：
1.有一个或多个限制性内切酶的切点，便于目的基因插入；
2.带有标记基因（抗性基因、荧光基因等），便于筛选；
3.大小合适（一般小于10kb），便于转染。
载体质粒示例：MCS（multiplecloningsite）：多克隆位点外源基因插入；
CMV启动子（以及SV40、bla、T7、U6……）：高效率启动基因表达；
SV40polyA信号（以及TKpolyA……)：转录终止，给mRNA添加polyA尾防降解；
neomycin/kanamycinresistanceORF新霉素(G)/卡那霉素抗性(以及Ampicillin氨苄、puromycin嘌呤霉素……）：用于细菌转化/细胞转染后的筛选。
限制性内切酶
识别DNA序列中的回文序列，并对两条链上特定碱基之间的磷酸二酯键进行切割，大多来源于细菌，根据细菌种属而命名。
选择限制性内切酶构建载体应注意：
1.单酶切后载体容易自连必须去磷酸化，不能保证插入片段的方向；
2.双酶切需要注意同尾酶的自连。
NEB限制性内切酶的信息解读
02
构建过表达基因质粒
表达基因扩增的引物设计：
1.NCBIGene数据库查找基因cDNA序列；2.查找CDS区序列的酶切位点，对比载体上的酶切位点，避免冲突（可使用primerpremier5软件或南京德泰生物镜像（网站））；3.CDS区首、尾序列+5’端加上酶切位点和（或）保护碱基（如下图）。表达载体构建简要流程
1.PCR扩增出基因CDS区，bp左右，胶回收；2.双酶切胶回收产物及载体，胶回收；3.酶切后的产物用T4连接酶(Takara)连接过夜，转化，鉴定。常见问题
1.引物特异性不好，PCR杂带太多或根本扩增不出来在CDS区的上下游重新选择引物，扩增成功后，以这个大一点的片段为模板扩增CDS区；
人基因ORF库购买。
2.PCR产物酶切不成功构建克隆载体，再酶切；
载体自连会使LacZ编码，在IPTG/X-Gal平板上呈现蓝色。
3.没有合适的酶切位点无缝克隆试剂盒。
4.没有合适的抗体加上标签，翻译成融合蛋白，比如His、HA、Flag、Myc等，N端C端均可；
引物设计：CDS区序列，5’端依次加上标签序列、酶切位点和（或）保护碱基；
载体自带标签，需要注意酶切位点处可能移码。
03
点突变质粒
1.使用高保真酶进行定点突变：PrimeSTARMaxDNApolymerase
PCR合成突变质粒，DpnI消化模板质粒，转化培养，后续测序鉴定。
2.使用无缝克隆连接进行定点突变：
PCR扩增出突变的线性化载体，无缝克隆连接成环状质粒，转化培养，后续测序鉴定。
04
CRISPR/Cas9质粒的构建
原理提要1.切割区的选择在于PAM序列-NGG；
2.特异性在于sgRNA的20个碱基；
3.Cas9失活：D10A、HA突变。sgRNA设计
1.NGG序列前面，长度20nt左右；2.GC含量在40-60%之间；3.尽量以G碱基开始，最后7个碱基的靶向性要好；4.尽量靠近基因编码区的ATG下游，第一或第二外显子。sgRNA设计网站推荐：