亮点：
?开发了一种基于分子内FRET效应检测SIRT1活性的新型NIR荧光探针。
?这是第一个使用具有良好抗干扰效果的NIR发射来检测SIRT1的示例。
?该探针不仅可以在体外检测SIRT1，还可以在活细胞中原位成像SIRT1。
组蛋白脱乙酰基酶（HDACs）在许多细胞代谢中（例如染色体重组、基因表达和细胞稳态中）起着重要作用，HDACs的异常水平可能与多种生物现象有关，包括血管生成、细胞凋亡和神经退行性疾病，因此迫切需要理想的荧光团以检测组蛋白脱乙酰基酶（HDACs）的酶促活性。已报道的用于检测HDAC的一步式荧光探针的发射波长仅限于可见光区域。HDAC检测的传统设计策略是在HDAC存在的情况下，利用脱乙酰前后探针的分子内电荷转移(ICT)变化。然而，基于脱乙酰通过改变ICT效应来对近红外荧光团产生影响是很困难的。荧光共振能量转移(FRET)过程可以有效地将较短波长的发射转移到近红外区域，因此本文作者选择了一种分子内的荧光共振能量转移机制。
作者构建了一种近红外（NIR）荧光探针Lys-OBD（方案一），基于分子内FRET效应具有NIR发射，可用于检测sirtuin1（SIRT1）的活性，Sirtuin1（SIRT1）是最重要的HDAC之一。Lys-OBD包含一个非发射性O-芳基NBD基团（OBD）和一个近红外发射Cy5荧光团。与SIRT1反应后，Lys-OBD中的非荧光OBD通过脱乙酰基反应，进行主链重排，将其改变为绿色发光硝基苯并恶二唑（NBD）。因此发生了在能量供体NBD和能量受体Cy5之间的分子内FRET，并且可以检测到Cy5的NIR发射。作者首先通过光谱研究和量子分子计算确定，由于NBD的发射和Cy5的吸收重叠，Lys-NBD的Cy5和NBD之间会发生荧光反应过程。对优化结构的Lys-NBD模型进行量子力学计算。作者利用密度泛函数理论对Lys-NBD构像进行优化。从计算结果可以看出，Lys-NBD与Cy5的最近距离为3.00?，表明供体和受体之间的分子内相互作用，折叠形式是最理想的构象。供体和受体之间的短距离(小于10?)保证了FRET的效率。
Lys-NBD在生理pH环境下稳定,作者测量了在SIRT1抑制剂EX存在和不存在的情况下，该探针在含SIRT1的水缓冲液中的吸收和荧光光谱。探针在nm和nm处分别显示了O-NBD和花菁染料的两个吸收带(图1A)。用SIRT1浸泡2小时后，在nm处出现了新的吸收峰，这是由新生成的NBD基团产生的(图1A)，而在nm处的吸收没有变化。同时，在0.1和0.2μMSIRT1中，探针在nm处的近红外荧光强度显著提高了5.3倍和6.7倍，说明该探针可以基于分子内的FRET效应检测到SIRT1的近红外荧光信号变化。在添加SIRT1之前，用抑制剂EX预处理Lys-OBD时，近红外荧光强度几乎没有变化(图1B)。实验结果表明Cy5信号的增加是由酶活性而不是其他因素介导的。
为了确定酶反应的产物，采用反相高效液相色谱法对Lys-OBD进行酯交换分析（图2）.HPLC结果显示，探针的初始保留时间为11.9min，随着孵育时间的延长，探针出现了一个新的峰，保留时间为11.2min。通过高分辨电喷雾电离-质谱(ESI-MS)在11.2min进一步分析新产品，作者确认了分子内迁移产品Lys-NBD。
作者研究了SIRT1的酶促反应动力学，并计算了一级速率常数k。荧光光谱显示，用SIRT1处理Lys-OBD后，近红外发射明显增强（图3A）。在分钟内不同时间点测定了nm处的荧光强度。通过将荧光数据拟合成指数方程，SIRT1的一级速率常数k为0.min-1(图3B)。为了研究Lys-OBD对SIRT1的检测限，作者在酶促反应中使用了不同浓度的SIRT1(图3C)。结果证实，酶效应显著放大的近红外荧光强度与SIRT1的量相关。同时nm处的荧光强度与nm以下的酶浓度呈良好的线性关系(图3D)，证实Lys-OBD可以准确测量SIRT1浓度。确定相应的SIRT1检出限为4.76nM。
然后作者继续检查Lys-OBD的适用性，以评估SIRT1抑制剂的抑制效果。图4实验结果表明探针可以用来研究抑制剂的活性和筛选潜在的抑制剂。考虑到O-NBD的活性，作者主要研究了正常浓度下不同胺和蛋白质之间的差异。荧光光谱显示，在nm处，这些胺和蛋白的荧光强度几乎没有变化，而只有在SIRT1存在的情况下，荧光强度才显著增加。（图5），实验结果表明，根据FRET过程的近红外信号结果，Lys-OBD可以明显降低高浓度氨基酸的干扰，该探针有可能用于SIRT1高表达细胞模型的成像。作者还研究了该探针在金属离子，离子和活性氧等无机物质存在下的选择性，nm荧光信号与这些物质无明显变化。细胞*性实验表明Lys-OBD具有应用于生物学的潜力。随后作者评估了探针成像活细胞中SIRT1活性的能力，图6实验结果表明该探针可以与SIRT1相互作用，并在活细胞中可视化酶活性。本文作者通过FRET机制进一步减少SIRT1检测过程中生物系统中丰富的高浓度氨基酸的干扰。所以该探针不仅可以在体外检测SIRT1，而且还可以实现首次在具有NIR荧光的高表达SIRT1的活细胞中成像SIRT1。
DOI：10./j.snb..
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