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荧光定量PCR是实验室最常用的实验，但对于首次接触它的人来说，总会遇到一些这样那样大大小小的问题，以下这一套中洪技术独家收藏的PCR小技巧，相信你能用得上，助在PCR的路上一帆风顺，少走弯路。
（请耐心花2分钟阅读完本文，建议推荐给小伙伴一起学）
（实拍图）
1提取RNA原理原理：
1.细胞在Trizol的作用下迅速破裂，样品匀浆化，使细胞内含物被溶解的同时，其中的RNA酶抑制剂能够保持RNA的完整性；
2.利用氯仿进行变性蛋白-抽提苯酚-分层（水相-蛋白质中间层-有机相）、乙醇沉淀RNA、吸附柱吸附分离RNA、Buffer缓冲液洗涤RNA。
操作步骤：
关键点：
样品细胞或组织的有效破碎，即裂解完全；
加入氯仿后，剧烈震荡充分；
对RNA酶的抑制；
提取RNA时，全程使用冰盒，RNA/miRNA保存于低温，最好-80℃,否则容易降解；
实验所用试剂均在有效期或反应成分仍有效（试剂盒、氯仿等）。
2测定浓度纯度操作1.UV-PC紫外分光光度计开机预热20min；
2.设定紫外波长nm，用ddH2O洗涤比色皿，向比色皿中加入50ulddH2O，放入样品室的S池架上，校零；
3.将待测样品稀释（RNA5ul用ddH2O稀释至50μl）混匀后，记录编号和稀释倍数；
4.把混匀的待测样品移入干净的比色皿中，放进样品室的S架上，记录稳定的OD(A)的值；
5.以同样的方式测待测样品在nm下的OD值；
6.计算待测样品的浓度与纯度:
RNA样品的浓度（ng/μl）=OD×稀释倍数×40;
纯度=OD/OD
举例
某客户某一组样品RNA测得OD=1.Abs，OD=0.Abs，根据计算公式可得：RNA浓度1.×40×10=.4ng/ul；RNA纯度1./0.=1.此浓度和纯度均适合做PCR。
问题分析
(1)蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD/OD比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。
(2)苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。
(3)多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致OD/OD比值偏低。因此，从这类材料中提取RNA时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。
(4)设备限制：测定OD及OD数值时，要使OD读数在0.1-0.5之间，此范围线性最好。用水稀释样品：测OD值时，对照及样品稀释液请使用10mMTris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。
3合成cDNA将RNA模板、PrimerMix、dNTPMix、DTT、5xRTBuffer、HiFiScript和RNase-FreeWater溶解并置于冰盒上备用。
根据以下表格配制反应体系，总体积为20ul.
试剂
20ul反应体系
终浓度
dNTPMix,2.5mMEach
4ul
uMEach
PrimerMix
2ul
RNATemplate
xul
50pg-5ug
RNase-FreeWater
upto13ul
70℃孵育10min，迅速冰浴2min。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。继续向以上反应液中加入以下试剂：
试剂
20ul反应体系
终浓度
5xRTBuffer
4ul
1x
DTT,0.1M
2ul
10mM
HiFiScript（U/ul）
1ul
50℃孵育15min，85℃孵育5min。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，加入量小于PCR反应体系的1/10,或置于-20℃长期保存。
注意事项：
1.加入各种逆转录试剂及RNA时，在冰盒上操作，以防RNA降解；
2.加入试剂后，分别进行各阶段的水浴，确保温度、时间，已便于酶促反应完全。
2PCRPCR由模板DNA的变性→模板DNA与引物的退火→引物的延伸三个基本反应步骤构成
根据实验要求，从NCBI库中查找相应引物的基因序列，利用primerpremier5软件查找出引物序列，按照设计原则，择优而选。
操作体系：
（1）配制成25ulPCR反应体系如下：
RNaseFreeddH2O
9.5ul
TemplateDNA
1ul
ForwardPrimer
1ul
ReversePrimer
1ul
2xUltraSYBRMixture
12.5ul
（2）PCR扩增条件：设置梯度退火温度查找
步骤
温度
时间
预变性
95℃
10min
变性
95℃
15s
退火/延伸
60℃
1min
融解曲线分析
95℃
15s
60℃
1min
95℃
15s
60℃
15s
PCR主要影响因素：（1）RNA浓度、纯度（2）退火温度的设置（3）引物设计