J.Am.Chem.Soc.
通过反应过程构建新的肿瘤靶点用于可分辨的多物质检测和多路径追踪
代谢（细胞代谢）是生物体内所发生的用于维持生命活动的一系列有序化学反应的总称。这些反应进程使得生物体能够生长和繁殖、保持它们的结构以及对外界环境做出反应。其中的化学变化一般都是在酶的催化作用下进行的。代谢是信号转导途径（是指可以将细胞外分子信号通过细胞膜传递到细胞内发挥作用的一系列酶促反应途径）之一。随着有机合成技术的进步，有机多功能荧光探针分子不仅可以用作生命系统中信号通路的荧光示踪剂，而且还可以用作干预生理和病理过程的药物。生命系统中有一类重要的含硫活性物质，主要有三类生物硫醇（高半胱氨酸（Hcy）；半胱氨酸（Cys）和谷胱甘肽（GSH））；二氧化硫（SO2）和硫化氢（H2S）。它们在有机体中形成一个交织的网络（图1）。其中，Hcy是甲硫氨酸代谢产生Cys的中间体，而Cys参与了各种蛋白质和主要抗氧化剂GSH的合成，因此Cys是细胞中硫代谢的核心物质。Cys的有氧或无氧代谢分别产生SO2和H2S。也有研究表明，GSH在活细胞中通过TST（硫代硫酸盐硫转移酶）在线粒体中产生SO2。近年来，有研究表明，活性含硫分子的浓度和代谢异常与多种疾病密切相关。如，生物硫醇和硫化氢与心血管疾病密切相关，内源性二氧化硫的浓度与癌症的发生和发展密切相关。因此，研究其代谢途径有助于有效干预，并预防相关重大疾病的发生和发展。最近几年，使用具有多结合位点的有机分子荧光探针来进行含硫物质检测或路径追踪已成为一种趋势。然而，生命系统中不同代谢途径常同时发生，开发能同时监测同一物质不同代谢途径的单一探针仍是一个巨大的挑战。针对这一问题，山西大学资源与环境工程研究所的程芳琴教授和山西大学分子科学研究所的阴彩霞教授通过探针与某些靶标之间的初步反应来构建新的反应位点，进而区分靶标或检测其代谢物，从而实现多个代谢途径的同时可视化追踪。通过在两个探针中分别引入三个反应位点，来实现对三种生物硫醇和SO2的早期区分。后期，谷胱甘肽与两种探针反应后，构建的C=N+部分可作为SO2的特异性反应位点，因此通过区分荧光示踪剂可以进一步了解SO2的Cys和GSH不同的代谢途径。
图1Cys和GSH在体内的代谢途径
首先，作者在纯PBS（pH=7.4）溶液中通过紫外可见光谱和荧光光谱变化，区分Cys/Hcy和GSH。荧光光谱中，Cys的浓度范围为0-μM时，Fnm具有良好的线性，LOD为0.10μM。对于Hcy/GSH（0-μM），LOD分别为0.02μM和0.04μM。这些结果表明探针1可以通过不同的激发和发射而用作Cys/Hcy和GSH的多结合位点荧光探针。此外，作者还研究了其pH依赖性，选择性和动力学，结果均表明探针1可在生理环境中传感。由于内源性SO2来源于硫醇的代谢，作者又进一步研究了探针1与不同硫醇反应后，与SO2反应的荧光变化来区分不同的靶点并检测SO2，进而实现半胱氨酸与谷胱甘肽代谢途径的区分。同理在DMSO/PBS=4/6（pH=7.4）中测定了探针2和硫醇之间的反应，也同样证明了其可区分Cys/Hcy和GSH。
图2探针1和探针2对硫醇和SO2的响应机制
之后，作者探讨了探针1对硫醇和SO2的响应机制，图2显示了探针1与硫醇和SO2的反应机理。探针1的醚键作为反应位点1可以与Cys/Hcy反应。因为Cys/Hcy的巯基具有亲核性，可以促进醚键的裂解，生成化合物(a)和(b)。化合物(a)与SO32-在位点3上加成后，共轭骨架被打断，生成化合物(c)，并通过质谱验证了这些产物。化合物(b)由于分子内重排而发出蓝色荧光。对于GSH，醚键也可以裂解为位点1，生成化合物(a)。与Cys/Hcy不同，由于GSH空间位阻的影响，没有发生分子内重排，而是与位点2相互作用，生成绿色荧光化合物(d)。将化合物(d)加入到SO32-中后，C=C双键加成，打破共轭体系，生成化合物(C)，并发现反应位点4（C=N+）是进一步添加SO2后新建立的一个反应位点。同样，通过质谱法验证了探针2与硫醇和SO2的反应机理。
图3HeLa细胞中内源性硫醇的时间依赖性共聚焦图像。HeLa细胞与探针1（10μM）孵育。蓝色通道：λex=nm，λem=-nm;绿色通道：λex=nm，λem=-nm;红色通道：λex=nm，λem=-nm。
接着，作者将HeLa细胞与探针1在PBS缓冲液中于37°C孵育，并记录了三个通道随时间的信号变化。随着时间的流逝，蓝色，绿色和红色荧光逐渐增加并稳定下来（图3）。表明探针1可以区别地检测细胞中的内源性Cys/Hcy和GSH。之后，在细胞水平上研究了硫醇存在时探针1对SO2的响应。实验表明，探针1在细胞水平上可以通过SO2区别检测Cys和GSH的存在。同样，也测试了探针2在细胞水平上响应靶标的发光性能，并且探针2具有在体内区分硫醇并通过构建新位点进一步区分SO2的能力。由于探针1对Cys和GSH的反应不同，因此在响应SO2后可以发出不同的荧光信号，基于此，作者在HeLa细胞中对Cys/GSH的代谢进行了荧光成像。其中蓝色通道荧光强度的增加反映了细胞中Cys的消耗，红色通道中荧光猝灭意味着SO2的生成。通过蓝色和红色通道荧光图像信号的变化反应了Cys和SO2浓度的变化。该实验证实，Cys可在活HeLa细胞中代谢产生SO2。接着，作者又研究了HeLa细胞中GSH的代谢情况。同样由绿色和红色通道荧光信号产生的图像来确定GSH和SO2浓度的变化。证实了在活HeLa细胞中GSH代谢会产生SO2。
图4（I）HeLa肿瘤裸鼠在不同时间点（0-2小时）静脉注射探针1的荧光成像。（II）HeLa肿瘤裸鼠在不同时间点（0-12h）静脉注射探针1的荧光成像。（III）在HeLa肿瘤裸鼠中静脉内注射探针1后，不同解剖器官（心脏，肝，脾，肺，肾）和肿瘤组织的荧光成像。红色通道：λex=nm，λem=-nm。
最后，作者在HeLa肿瘤裸鼠中进行了Cys/GSH代谢的荧光成像。首先，通过对小鼠进行皮下注射，观察到探针1在小鼠中仍然具有良好的成像能力和反应性。之后评估了探针1监测HeLa肿瘤裸鼠中Cys和GSH代谢的能力，实验表明，探针1可以实现肿瘤中Cys和GSH代谢SO2的可视化。而且，GSH的SO2代谢比Cys快得多，这可能是由于有机物中GSH含量高。由于该探针中的苯并吡啶离子带有正电荷，因此作者对探针1进行了肿瘤靶向性研究。结果表明，探针1具有靶向线粒体（线粒体中含有大量的活性氧，而且线粒体具有独立的遗传系统，对一些重要蛋白的表达起决定性作用，线粒体的损伤将加速肿瘤细胞的凋亡过程，因此线粒体已成为肿瘤治疗的重要靶点）的功能。之后，作者通过静脉注射探针1在HeLa肿瘤裸鼠体内验证了靶向肿瘤的可行性。从图4（ID1）中可以看到探针在1h到达肿瘤部位。然后，荧光信号逐渐在肿瘤区域富集。注射6小时后，可以将肿瘤区域与周围其他正常组织区分开（图4IID2）。注射后12h后，肿瘤区域的荧光信号达到最大值（图4IIF2）。随后，分离肿瘤组织和主要器官并进行成像。如图4IIIB所示，肿瘤显示出强荧光信号，而肝脏和肺部仅显示相对弱的荧光。这些数据清楚地表明了探针1的肿瘤靶向性。最后，作者将不同浓度的探针1静脉内注射到HeLa肿瘤裸鼠中，然后通过测量相应的肿瘤体积来评估肿瘤的治疗效果，结果表明，探针1消耗的硫醇无法在五天的周期内阻止肿瘤的生长，即肿瘤的治愈与硫醇浓度无关。
总之，作者设计并合成了两种可在细胞及小鼠体内同时检测多种代谢途径的新型探针，其中，含苯并吡啶离子的探针能有效靶向肿瘤，并提供相关代谢信息。为未来肿瘤靶向药物的荧光诊断与治疗一体化提供了研究基础和新思路。
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