免疫分析经过半个多世纪的发展，已经发展出了很多种类。根据测定过程中是否要将待测物质与反应体系分离可分为非均相免疫分析和均相免疫分析；非均相免疫分析，是指在引入探针进行标记的操作过程中，各种相关试剂混合反应后需要进行分离，将待测物与反应体系分离开后再进行检测，是现在免疫分析中的主流方法。如广为人们熟知的酶联免疫吸附法(ELISA法)和化学发光法等。均相免疫分析指在测定过程中将待测物与反应体系中的相关试剂混合反应后直接测定，其关键问题在于如何灵敏的定量区分免疫反应溶液中抗体（或抗原）和抗体-抗原结合产物。截至目前，多种灵敏的检测方法已被应用于均相免疫分析，比如光学检测方法、电化学检测方法，都取得了较好的分析效果，有些已在实际应用中被广泛使用。
常见均相发光免疫和非均相发光免疫分析介绍
以下对常见的均相发光——光激化学发光、电化学发光；
非均相发光——酶促化学发光、直接化学发光进行简述。
光激化学发光技术
光激化学发光技术起源于年EdwinF.Ullman等发明的LOCI（Luminescentoxygenchannelingimmunoassay）技术，在国外由DadeBehring公司应用于临床免疫诊断检测，PerkinElmer公司将该技术应用于科研试剂，称为AlphaLISA(AmplifiedLuminescentProximityHomogeneousAssay)。LOCI最初用于药物浓度的检测，之后逐步发展为微量检测技术。检测原理是在抗原-抗体特异性反应的基础上利用供体微球在极短距离（nm）将激发态单体氧传递至受体球，使受体球发光，根据所检测到的光信号强度定量被检测物的浓度。国内学者对此项技术进行引进和吸收并建立光激化学发光（LICA），其测定原理与LOCI类似。
该均相发光免疫分析系统有两个微球(（供体微球和受体微球）组成,供体微球含有光敏物质表面覆盖有水凝胶可与链霉亲和素类活性物质结合；受体微球含有发光物质且表面的水合凝胶可以与活性分子（抗体、生物素）结合。利用作为供体和受体的微珠来检测生物分子的相互作用，当生物分子存在相互作用时，这种相互作用会将供体和受体微珠拉近，从而激发级联放大的化学反应，产生极大增强了信号。具体来说，在激光（波长nm）的照射下，供体微珠上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧。单体氧扩散至受体微珠，与其上的化学发光剂反应，进一步激活了同样在受体上的荧光基因，使之发出突光，波长为-nm。单体氧的半衰期为4微秒，在溶液中的扩散距离为mn左右。如果生物分子不存在特异的相互作用，单体氧无法扩散到受体微球，则不会有发光信号产生。光激发光免疫分析原理如下图所示。
电化学发光
电化学发光免疫分析是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗原（抗体），以三丙胺（TPA）为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。
在电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体包被抗原（抗体），用三联吡啶钌标记抗原（抗体），在反应体系内待测标本与相应的抗原（抗体）发生免疫反应后，形成磁性微粒包被抗体-待测抗原—三联吡啶钌标记抗体复合物，这时，将上述复合物吸入流动室，同时引入TPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反应，使三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光，光的强度与待测抗原浓度成正比。电化学发光免疫分析示意图见下图。
酶促化学发光
是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（ALP）作为标记酶的均属酶促发光。迈克生物的化学发光产品即是采用的HRP酶促发光系统。HRP标记化学发光技术（双抗体夹心法）原理见下图.
直接化学发光
直接化学发光是指在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。吖啶化学发光免疫分析示意图见下图。
结论
均相发光免疫分析具有均相、一步、免清洗和高通量检测等一系列优点，使检测精密性更高，但同时存在HOOK现象，而且溶血和*疸对测定结果有影响。
非均相免疫分析涉及抗原（抗体）的固定和清洗分离步骤，使检测时间增长，但可以提高分析灵敏度，降低检测下限，同时抗干扰能力更强，是目前市场上的主流分析方法。
化学发光免疫分析技术自上世纪70年代中期Arakawe首先报道至今已经成为一种成熟的、先进的超微量活性物质检测技术，应用范围广泛，近10年发展尤其迅猛，是目前发展和推广应用最快的免疫分析方法，也是目前最先进的标记免疫测定技术，必将得到更广泛的应用。
作者：迈克生物技术部
（该文章转载整理自《迈》杂志第十一期）
注：封面图片来源于网络
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