图1:EPI-在基于报告的检测中抑制ARTAU1和TAU5结构域的转录活性。(A)基于gal4的AR表达结构示意图。(B)EPI-和BABDHE的化学结构。(C和D)用如图A所示的结构物和sPSAGal4-荧光转染LNCaP和C4-2细胞，并按照指示处理(V:空白对照;E:EPI50μM;B:BABDHE50μM)。(C)无血清和雄激素处理的LNCaP裂解液进行免疫印迹。(D)LNCaP和C4-2蛋白裂解液进行荧光素酶检测。。(E和F)T细胞用图A中所示的结构物和pg5荧光素酶转染，并用指定的药物处理。
该课题组首先测了EPI-抑制ARTAU1和TAU5的转录活性。LNCaP细胞经一系列浓度的EPI-处理，以确定有效抑制AR反应性荧光素酶报告因子的剂量。与之前的报告显示，10μMEPI-能够实现对AR的强大抑制，相反，他们观察到需要50μM剂量(我们和他们课题组结果相近，在20μM抑制效果不明显)。他们开展了启动子链接的ARGal4混合在ARDBD被替换为酵母Gal4DBD(图1,构造2)。作为一个阴性对照,他们用双酚a双(2,3-dihydroxypropyl)醚(BABDHE),由于其结构与EPI-相似，但含有二醇而不是反应性氯醇(图1B)。EPI-抑制LNCaP细胞中依赖配体的ARGal4的转录活性(图1C和1D)，以及CRPCC4-2细胞系中异常的、不依赖配体的ARGal4的转录活性(图1D)。从ARGal4中删除TAU5增加了雄激素依赖的ARGal4活性，这与之前的报道一致，但这一删除并不影响对EPI-的响应性(图1D)。相反，TAU1的缺失降低了LNCaP和C4-2细胞中雄激素依赖和非雄激素依赖的ARGal4转录活性模式(图1D)。这排除了对LNCaP中EPI-对TAU1影响的评估，但C4-2细胞中残留的雄激素独立的ARGal4转录活性仍对EPI-有反应(图1D)。为了直接测试不同的ARTAUs（TAU1，TAU5）对EPI-的响应性，他们将整个ARNTD，或TAU1或TAU5片段连接到Gal4DBD上(图1B，构建了5-7)。在所有被测试的细胞系中，EPI-抑制了NTD-Gal4杂交的转录活性(图1E,1F)。Gal4-TAU1和Gal4-TAU5融合蛋白显示出细胞系特异性的转录活性，这可能是由于在PCa细胞系中表达不足(图1E,1F)。在T成纤维细胞中，Gal4-TAU1和-TAU5构建物的转录活性被EPI-有效抑制(图1E和1F)。这些数据与之前有关EPI-直接抑制AR的报道一致，但通过证明这种抑制效应不能归结到特定的ARTAU区域，从而扩展了这一认识。这表明了两种可能的情况:1)EPI-特异性地与TAU1和TAU5结合，或2)EPI-对TAU1和TAU5的转录活性有更广泛的影响。
图2:EPI-在mRNA水平抑制内源性AR表达。(A)雄激素敏感的PCa和(B)CRPC细胞系在无血清的1nMDHT和/或50μMEPI-培养基中处理过夜，并通过免疫印迹分析。提供了全长(AR-fl)和截断变体(AR-v)的密度测定数据。(C)采用qRT-PCR方法分析经50μMEPI-处理的LNCaP(左)和C4-2(右)细胞在指定时间点的ARmRNA表达情况。(D)LNCaP细胞用50μMEPI-处理或在无血清培养基中对照8h。
EPI-抑制内源性ARmRNA和蛋白的表达。有趣的是，他们发现EPI-处理的PCa细胞系中内源性AR蛋白水平持续受到抑制(图1C)。为了探索这一现象，他们测试了EPI-对雄激素敏感的PCa(图2A)和CRPC(图2B)细胞系中AR蛋白水平的影响。在这些细胞系中，用EPI-处理之后，可以不同程度地降低了全长AR蛋白的表达(图2A和2B)。AR蛋白丢失发生在治疗8到16小时之间，且与蛋白酶体无关。与此相一致的是，在LNCaP和C4-2细胞对EPI-反应的时间点上，在观察到的AR蛋白表达下降之前，ARmRNA表达降低(图2C)。EPI-也抑制了LAPC4细胞中AR和AR靶基因PSA的mRNA表达(补充图S7A)。EPI-处理也降低了CRPC22Rv1细胞系中表达的截断AR变异(AR-v)蛋白的表达(图2B)。有趣的是，CWR-R1细胞中的ARmRNA(补充图S7B)和蛋白表达(图2B)对EPI-没有反应，EPI-也没有抑制AR靶基因FKBP5的表达(补充图S7B)。为了检验EPI-对AR表达的影响是否是由于降低了ARmRNA的稳定性，我们用放线菌素D单独或联合EPI-处理LNCaP。在放线菌素D进行转录阻断后，使用EPI-治疗并没有加速ARmRNA的减少(补充图S8)。与此相一致的是，他们发现50μMEPI-降低了LNCaP细胞中新生ARmRNA的合成速率(图2D)。总的来说，这些数据表明EPI-抑制AR基因的转录。
图3:EPI-介导的AR表达和PCa/CRPC细胞生长的剂量依赖性抑制。(A)LNCaP、C4-2和22Rv1细胞在含1nMDHT和/或EPI-的无激素培养基中处理7天。结晶紫染色法监测生长。(B)LNCaP,C4-2和22Rv1细胞在无血清培养基中处理24小时，如(A)，并进行westernblot。提供了密度测定数据。(C)用EPI-处理AR阴性的PC-3和DU细胞，并分析其生长情况。
抑制AR表达与PCa和CRPC细胞系细胞生长减少相关。基于这些发现，他们推测抑制AR合成可能是EPI-抗AR机制的重要组成部分。EPI-在低浓度时抑制LNCaP细胞的生长，但在所有其他PCa细胞系中，EPI-抑制生长的浓度(图3A，补充图S9)与抑制AR或AR-v蛋白表达水平的浓度相同(图3B)。BABDHE也抑制了PCa和CRPC的生长和AR表达，尽管需要比EPI-更高的剂量(补充图S10A和10B)，表明EPI-氯醇部分对抑制AR表达很重要。令人惊讶的是，EPI-也抑制AR阴性PC-3和DU细胞的生长(图3C)，以及T47D乳腺癌细胞系(补充图S11A和11B)。在T47D，观察到AR以及雌激素和孕激素受体(ER和PR)的双相调节(补充图S11C)。这些数据表明EPI-在多种细胞类型中的作用与AR无关。
图4:EPI-和PPAR-γ激动剂曲格列酮对AR表达和转录活性的影响相似。(A)用sPSA-荧光素酶转染LNCaP细胞，按指示用曲格列酮(TGZ)或EPI-处理，并进行荧光素酶检测。(B)如所示，用曲格列酮(TGZ)或EPI-处理LNCaP细胞，并进行免疫印迹。(C)分别用所示的gal4-栓系AR结构物和sPSAGal4-荧光素酶或pG5-荧光素酶转染LNCaP和T，并按所示用10μM曲格列酮或对照物处理。
EPI-在PCa细胞中的作用类似于PPARγ激动剂，曲格列酮。双酚A二缩水甘油醚(BADGE)在结构上与EPI-相关，但含有一种双环氧化合物，已被证明是一种选择性PPARγ调节剂(SPPARM)，在不同的细胞类型中具有不同的作用。鉴于PPARγ也被证明在前列腺发育和维持中发挥作用。PPARγ受体激动剂如曲格列酮在体外和体内抑制AR表达及PCa细胞生长,他们推断PPARγ调制可能是EPI-在PCa细胞一个意外的作用。的确，曲格列酮或EPI-在LNCaP细胞的启动子报告基因测定中导致了AR转录活性的抑制(图4A)，剂量与AR蛋白表达抑制相关(图4B)。此外，用曲格列酮或EPI-处理LNCaP细胞可导致AR蛋白水平的剂量依赖性降低以及p21和p27的诱导(图4B)。曲格列酮抑制AR表达的剂量低于以往的研究，这可能是由于在他们的研究中，药物治疗过程中细胞培养基中没有血清。最后，曲格列酮处理也抑制了ARGal4的活性，以及Gal4连接的ARNTD、TAU1和TAU5的活性(图4C)，类似于EPI-在这些模型中的作用(图1D和1F)。
图5:PI-和曲格列酮抑制临床前列腺癌组织中AR的表达和活性。(A)新鲜前列腺癌组织培养的外植体模型示意图。(B和C)PCa组织外植体按指示用EPI-或曲格列酮(TGZ)处理48小时，然后进行(B)westernblot或(C)qRT-PCR。
为了将这些观察扩展到临床疾病，他们使用曲格列酮和EPI-作为外植体处理保存的新鲜人体PCa组织(图5A)。该模型中使用的EPI-和曲格列酮的剂量比体外实验增加了2-4倍，以反映在体内或体外实验中使用的更高剂量的药物。重要的是，EPI-和曲格列酮均能降低PCa外植体中AR蛋白、ARmRNA和AR靶基因的表达(图5B和5C)。
图6:PI-是一个选择性PPAR-γ调节剂。(A)用pprex3-tk荧光素酶转染LNCaP细胞，按指示处理8小时，并进行荧光素酶检测。(B)用EPI-处理PC-3细胞过夜，分离RNA，用qRT-PCR分析PPARγ靶基因表达。(C)用靶向AR或PPARγ的siRNA转染LNCaP细胞，并按提示用米波列酮(Mib)、曲格列酮(TGZ)或EPI-处理。采用qRT-PCR方法分析AR靶基因的表达情况。
EPI-是PCa细胞中PPARγ的选择性调节剂。接下来他们测试EPI-在PCa细胞中的SPPARM活性。发现与曲格列酮类似，EPI-激活LNCaP细胞中PPARγ反应元件(PPRE)调控的荧光素酶报告基因(图6A)。SPPARM活性与AR无关，曲格列酮和EPI均诱导AR-nullPC-3细胞系中PPARγ靶点CIDEC、TXNIP和PDK4的mRNA表达(图6B)。然而，在分化为PPARγ阳性脂肪细胞的3T3L1细胞中，EPI-抑制PPARγ经典靶基因aP2和LPL的表达(补充图S12A)，并抑制脂滴形成(补充图S12B)。这些效应与之前的报道一致，在微摩尔浓度下，BADGE-介导抑制的3T3-L1脂肪细胞PPARγ活性。总之，这些细胞类型特异性PPARγ激动剂/拮抗剂作用支持EPI-的SPPARM功能，噻唑烷二酮类作用于PCa细胞中的PPARγ活性。
图7:PI-在溶液中转化为反应性环氧化物，并与硫醇形成共价加合物。(A)将EPI-转换为化合物2的方案。EPI-在pH为2.4、7.4和9.4的PBS/DMSO中37°C震荡。(B)EPI-转化为化合物的高效液相色谱图。用LC-MS分析反应混合物，确定环氧化合物的存在。(C)活性硫醇对EPI-进行共价修饰的方案。EPI-溶液和硫醇的PBS/DMSO溶液pH分别为2.4、7.4和9.4，在37°C摇晃。(D)EPI-和硫醇之间形成共价加合物的HPLC色谱图(t=12小时)。在反应过程中出现的新峰与背景信号不同(补充图20A)用星号表示。剩余百分数由t=12h时测量的EPI-剩余量除以t~30min时剩余量并乘以%计算。
EPI-与硫醇在体外形成共价加合物。由于SPPARM活性不能完全解释EPI-的多级抗AR效应，双酚A(BPA)和BADGE是用于聚碳酸酯塑料和环氧树脂生产的内分泌干扰物。BADGE及其相关化合物中的环氧环很容易与底物在水溶液中发生水解和盐酸反应，生成羟基化和卤化衍生物，其中EPI-就是的一个例子。氯醇部分在水溶液中也具有自发转化为环氧化合物的潜能。因此，他们使用HPLC来询问EPI-是否可以在溶液中转化为BADGE的单环氧化合物(化合物2，补充图S2)。的确，在中性和碱性pH下培养12小时后观察到环氧化物(图7A和7B)，但在酸性条件下没有观察到(补充图S14A和S14B)。化合物2的鉴定采用标准品共注射和LC-MS分析(补充图S15)进行确认。BADGE已被证明与塑料衬里的罐头食品蛋白的亲核侧链发生反应，这与EPI-特异性AR结合机制的反应相同。在之前的研究中，没有观察到EPI-与亲核硫醇的非特异性反应。然而，鉴于他们观察到EPI-在中性和碱性pH下都能自发转化为环氧化合物，且BADGE对亲核试剂具有反应性，他们对EPI-在不同pH条件下与亲核巯基谷胱甘肽、2-巯基乙醇和半胱胺的反应性进行了研究(图7C)。没有EPI-:在酸性条件下形成硫醇加合物(补充图S16A和S16B，补充图S17)。然而，EPI-与谷胱甘肽的反应在pH值为7.4条件下产生了微量的硫醇加合物,在pH值为9.4的条件下，12小时后几乎完全转化为谷胱甘肽加合物(图7D)。同样，2-巯基乙醇在中性pH条件下生成的加合物有限，但在碱性pH条件下完全转化为加合物(图7D)。最后，EPI-在pH7.4时不与半胱胺发生反应，但在pH9.4时几乎完全形成加合物(图7D)。所有的EPI--硫醇加合物均经质谱鉴定(补充图S18A-S18C)。此外，单环氧化合物，化合物2，与所有硫醇形成加合物，并显示出增强的整体反应活性(补充图S19A-S19C)。总的来说，这些数据表明，在中性和碱性ph的溶液中，EPI-会自发地转化为更活泼的环氧化物。他们的结果表明，EPI-是一种反应性亲电试剂，它可能通过局部pH值的影响在调节蛋白质方面表现出一定的选择性。
总结
本研究中，该课题组描述了EPI-对AR和PPARγ通路有意想不到的多水平作用，其可以导致抑制细胞生长。在之前的报道中，EPI-通过与EPI-氯醇基团的亲核取代反应特异性与ARNTD结合，从而通过阻断未识别的CBP结合域来抑制AR活性。在本研究中，他们无法指定一个不同的ARNTD基序来解释EPI-介导的AR转录抑制的具体机制。相反，他们发现EPI-抑制了AR在PCa细胞系和临床组织中的合成，其剂量与抑制AR靶基因和PCa细胞生长的剂量一致。在这种AR表达抑制和细胞生长抑制之间的一般剂量关系中，LNCaP细胞系是一个例外，对EPI-和BABDHE-介导的生长抑制表现出最高的敏感性。这很重要,因为大多数支持EPI-对AR的疗效和特异性的临床前数据都是通过LNCaP模型产生的。此外，他们还发现EPI-能够抑制AR阴性PC-3和DU细胞的生长。这些数据与之前的报告冲突，但他们认为这种差异是由于实验设计的两个关键差异。首先，他们的研究纳入了较长期(即7天)生长分析，而不是早期时间点(即3天)BrdU纳入读数。其次，之前的报道使用10μMEPI-治疗PC-3和DU，在他们的研究中，这个剂量对PC-3和DU的生长没有抑制作用，但对LNCaP细胞有抑制作用。这些数据强调了细胞系对EPI-的特异性反应，这支持了早期关于AR特异性的结论。他们的数据表明PPARγ激活至少代表EPI-在PCa细胞中的一个AR独立活性。然而，EPI-在经典的3T3-L1脂肪细胞模型中显示PPARγ抑制活性，表明SPPARM活性与纯激动剂活性相反。EPI-的SPPARM活性与研究表明的化学相关化合物BADGE是一种与PPARγLBD结合的SPPARM，与合成的噻唑烷二酮PPARγ激动剂(包括曲格列酮)相比，在PCa和3T3-L1细胞中表现出明显的分子效应。此外，他们从硫醇反应性测定的数据表明，小分子硫醇(例如，谷胱甘肽，2-巯基乙醇，半胱胺)很容易被EPI-烷基化，并且这种反应活性在酸性和中性pH值下减弱。他们的数据表明，任何在适当的碱性结合袋内具有亲核残基的蛋白质都可能是EPI-共价修饰的靶点。这进一步得到了BADGE在体外的活性的证实，以及他们的数据，即EPI-在溶液中在生理pH值下转化为类似的环氧化物(化合物2)。这些数据表明，除了报道的与AR和PPARγ的相互作用外，EPI和BADGE还具有实质性的蛋白质组反应特征。这些新数据表明，可能需要对EPI-的核心双酚以及共价弹头进行结构改变，以减轻本研究和*理学文献中报道的独立效应。然而，这一任务是复杂的，因为本就无序的ARNTD没有三维结构的报道，这阻碍了改进抑制剂的合理设计。然而，外消旋EPI-的(2R,20S)异构体EPI-在小鼠中显示出更强的AR相互作用和降低*性，表明这一方向可能是可行的。他们发现EPI-介导的AR活性抑制与PCa中AR表达的抑制和PPARγ的激活有关，同时发现EPI-可以捕获亲核硫醇，对于正在进行的EPI-和其他靶向功能域独立于ARLBD的抗AR化合物的临床前开发非常重要。
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