杂萜类化合物是一种广泛分布的天然产物，近年来其生物合成已被深入研究，但随着基因组测序的快速发展和积累，还有许多结构未知的杂萜类化合物有待发现。在真菌中，由3,5-dimethylorsellinicacid(DMOA)衍生的杂萜含有大量结构新颖的分子，与其生物合成途径中多样的后修饰酶有关，包括α-酮戊二酸(α-KG)依赖的双加氧酶。香港城市大学YudaiMatsuda助理教授团队从曲霉Aspergillusfuniculosus中鉴定到一个包含α-KG依赖双加氧酶的隐匿杂萜类生物合成基因簇，通过异源表达激活该基因簇后分离到4个新的杂萜类化合物funiculolidesA?D(1-4)，其合成前体为5-methylorsellinicacid(5-MOA)，不是DMOA。终产物funiculolideD具有独特的螺环戊酮结构，该结构由α-KG依赖的酶FncG催化形成。
通过生物信息学分析在曲霉A.funiculosusCBS.56中鉴定到一个类似anditomin(and)的生物合成基因簇，命名为fnc。分析显示：聚酮合成酶FncE、细胞色素P酶和水解酶的嵌合蛋白FncD、异戊烯转移酶FncB、FAD依赖的单加氧酶FncA、萜烯环化酶FncH、短链脱氢酶FncC以及α-KG依赖的双加氧酶FncG都和and基因簇中有同源蛋白(图1A,B)；基因簇fnc中多编码一个短链脱氢酶FncF，此外，α-KG依赖的双加氧酶FncG与AndA的氨基酸序列同源性相对较低(＜40%)，推测fnc途径以与anditomin生物合成相同的方式生成preandiloidB(图1A)；之后，FncF和FncG对preandiloidB进行修饰，产生新型杂萜类化合物。图1.(A)Anditomin的生物合成途径；(B)基因簇fnc与and的同源性比较为验证猜想，研究人员将fncEDBAHC这6个基因导入异源宿主AspergillusoryzaeNSAR1中，检测到化合物1的产生(图2A)。核磁数据显示1是preandiloidB去甲基类似物，命名为funiculolideA(图2B)。因此，1的前体是5-MOA，不是DMOA，但合成方式类似preandiloidB(图2B)。接着确定了剩余两个基因的功能。导入基因fncG到产生1的转化株中时没有新产物生成，而导入基因fncF时检测到2的产生(图2A)，命名为funiculolideB(图2B)，并通过晶体结构确定了2的绝对构型(图2C)。最后将8个基因都导入A.oryzae中，检测到3的产生(图2A)，命名为funiculolideC(图2B)。同时，纯化3时检测到化合物4的存在，但产量太低无法鉴定其结构。图2.(A)A.oryzaeNSAR1转化株发酵提取物HPLC图谱(λ=nm)；(B)funiculolidesA-C(1-3)的结构；(C)化合物2和3的x射线晶体结构。为深入研究FncG的催化功能，研究人员在大肠中纯化了FncG，然后分别以1、2或3为底物，在FeSO4、α-KG和抗坏血酸存在下检测反应产物，其中，以1为底物时没有新产物产生；以2和3为底物时都产生了4(图3A)。接着以3为底物进行大规模体外酶反应，成功纯化得到了4并确定了结构(图3B)。随后通过在不同条件下进行酶促反应来进一步了解FncG的催化性质。结果证实金属离子和α-KG是FncG催化必需的辅因子，去除抗坏血酸对反应没有明显影响(图3A)，而FncG同源蛋白AndA的体外酶反应中必需添加抗坏血酸。图3.(A)FncG与1，2或3的体外酶反应HPLC图谱(λ=nm)；(B)funiculolideD(4)的结构。根据以上实验结果推测出funiculolides的生物合成途径(图4A)，其生物合成过程表明，以5-MOA作为起始单元可与其他DMOA衍生的杂萜相互组合，合成一系列去甲基的类似物，进一步扩大真菌杂萜类化合物的多样性。Funiculolide生物合成的另一特征是α-KG依赖的双加氧酶FncG催化螺环的形成，推测反应机制如图4B所示。图4.(A)推测的funiculolides生物合成途径；(B)推测的FncG催化螺环戊酮生成的反应机理。综上所述，研究人员通过异源表达和体外酶反应实验，成功获得了4种新的真菌杂萜化合物funiculolideA-D。体外生化实验证明α-KG依赖的双加氧酶FncG催化生成螺环戊酮结构，扩展了α-KG依赖的酶催化反应类型。研究表明进一步的基因组挖掘和组合生物合成将有助于扩大真菌杂萜类天然产物的多样性。YudaiMatsuda助理教授的研究方向是真菌活性天然产物的生物合成及基因组信息指导的天然产物发现。文章信息：DexiuYanandYudaiMatsuda*.GenomeMining-DrivenDiscoveryof5?Methylorsellinate-DerivedMeroterpenoidsfromAspergillusfuniculosus.Org.Lett.(8),-