01
遇见/摘要
本文作者通过人工设计萜环化酶活性中心氢键结合方式、动态调控底物锚定模式实现定向阳离子级联反应。具体为改变氨基酸锚与底物重新形成配位作用、定向控制反应进程生成单环产物、重塑萜环化酶活性关键氨基酸实现高选择性和高收率合成类胡萝卜素，香精和香料等化合物。
02
遇见/内容
天然酶促级联反应体系可通过分子间或分子内C-C，C-X偶联反应等完成高效、高选择性多步串联催化过程（图1A），反应关键在于前体物质的选择、反应进程的方向和反应终止的控制。但目前对于化工品的生产相关级联策略有待进一步发展（图1B，图S1）。
萜类环化酶可以催化不同链长的异戊二烯单元合成单环或者多环的萜类化合物核心骨架，是萜类化合物结构多样性的基础。之所以环化反应可以在酶的活性腔中顺利进行，是因为阳离子中间体和过渡态能够稳定存在，从而使阳离子级联反应顺利进行。在人工生物合成途径改造过程中可以通过引入不同底物或破坏氢键等方式设计活性位点内的氨基酸锚实现阳离子环化级联反应的精确调控（图1A）。例如作者在前期研究中利用角鲨烯环化酶(squalenehopenecyclase,SHC)的质子化机制拓展其反应杂泛性(Naturechemicalbiology11.2():-.)。
本文作者进一步延伸上述研究，通过引入锚定官能团利用AacSHC高立体选择性催化阳离子级联反应，生成类胡萝卜素、香料、香精等化合物（图1C）。
G为转换较小底物的热点残基，作者首先测试1c和1t以探索定向级联环化产物的起始突变体，但AacSHCGR均主要生成双环产物，不生成3（图式1）。
接下来作者通过蛋白质工程改造促进级联反应向单环化方向发展，G定点饱和突变结果表明小的氨基酸和极性氨基酸促使单环化反应。对接结果如图2所示，并表明两个主要的预折叠状态：预折叠状态1中由于Y的羟基对羰基部分具有锚定作用，有利于双环化。在预折叠状态2中通过GT和Y与羰基部分形成氢键，使氧原子背对碳正离子最终形成单环产物。此外，根据对接结果，对L位置进行了点突变发现体积小的氨基酸利于单环化反应。根据预折叠状态1作者破坏了Y与底物1c羰基部分的氢键作用，双环化产物明显减少。随后作者通过定向进化筛选得到突变体V。最后作者用硫酸催化3的环化反应高选择性生成光学纯的7。
之后作者进行机理和底物谱研究。可能的催化机制如图3B所示：底物1c进入活性位点后，其羰基部分被GT锚定，由于LA体积变小羰基部分向Y方向翻转形成强的氢键作用，最终经预折叠、质子化作用和去质子化作用生成3。最后作者研究底物类似物的环化反应（图3C）。不同官能团和链长的1c底物类似物（8、10、12）均产生单环产物（9、11、13）。不仅显示出氨基酸分子锚的可塑性和适配性，而且可以通过人工生物合成途径设计实现克级反应合成高产值化合物。
催化中核心元素，如辅因子、底物通道等通常是蛋白质工程化改造的焦点，而本文作者将重点集中在核心元素分子锚上，工程化的萜环化酶催化氢键介导的定向阳离子级联反应，为相关香料，香精，制药等行业的绿色生物制造提供酶工具箱。
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遇见/致谢
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