献给初学者WB如何1分钟蛋白定量 - 酶

TUhjnbcbe - 2021/8/19 8:27:00

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不管是临床医生和科研工作者，我觉得二者的共同敌人都是一致的，那就是时间。作为一个临床医生，没（zen）事（me）儿（ke）的（neng）时候搞搞科研，必须想尽一切办法对付（挤出）时间。

去年，我们已经成功把WB一抗过夜之前的操作时间缩短为1.5小时，这样有更多的时间来看（he）文（ka）献（fei）了，最大的好处是天黑之前或者下班之后随时都可以开始WB，不用担心细胞处理时间长或不能回家过夜的问题了。

不了解的同学可以看看这篇《献给初学者：WB也有基本套路》，毛老师在丁香园公开课里详细解释了原理和操作，粉丝们的评价还不错。

虽然WB的时间大大缩短了，但毛老师依然有点小小的不满意。因为在开始WB之前的蛋白定量耗费时间还有点长，如果用BCA法的话光孵育就需要半个小时，整个过程耗时接近1小时。因此为了配合快速WB，我们同样需要一个快速蛋白定量的方法。因此今天我们来聊聊如何1分钟测出蛋白浓度。

蛋白定量法

开始之前我们有必要复习一下理论知识。蛋白定量至少有5种方法：BCA，Bradford，双缩脲法（Biuret法），Folin法（Lowry法）和紫外分光光度计法。

BCA法的原理是在碱性条件下，氨基酸将二价铜还原为一价铜与BCA形成紫颜色的络合物，测定nm的OD值，所以如果样本里有还原剂（比如DTT）的话就会对BCA的结果产生干扰。

Bradford法（考马斯亮蓝法）是在酸性条件下，加入考马斯亮蓝G与蛋白质（主要是碱性或芳香族氨基酸）结合为蓝色化合物，吸光度值从nm变成nm，最后测定nm的OD值来计算蛋白质浓度。

双缩脲法或Folin法由于检测灵敏度不够高，早已被BCA或Bradford法所代替。

而紫外分光光度计法是利用氨基酸在nm处有吸收峰来定量，由于不同氨基酸吸收峰值略有不同，故在蛋白质成分单一的情况下使用佳，比如蛋白纯化后估测蛋白的浓度。

每个实验室都有各自的传统，在方法选择上青菜萝卜各有所爱，但绝大部分实验室要么用BCA要么用Bradford法进行蛋白定量。

下图简单总结了一下BCA和Bradford法各自的优缺点。

快速测蛋白法

显然，要想加快速度最好是选用Bradford法了。但是，Bradford也存在一些问题，比如标准曲线线性相关性不佳，容易受Triton，SDS等去垢剂的影响等等。

好在我们都是站在前人的肩膀上，前人早已开发出去垢剂兼容型的Bradford试剂，性能优于常规Bradford法，比BCA法更快更方便。今天我们讨论的方法就是基于去垢剂兼容型的Bradford试剂来快速蛋白定量。不知道上哪里买的同学可以在丁香通上找找。

下图就是用Bradford法测出的标准曲线。虽然线性拟合不佳（R=0.），但是二项式吻合度却非常高（R=0.），可以说非常完美了。

下图展示了如何在excel中制作二项式标准曲线。

到此为止，前面我们担心的几个问题就已经全部解决了。第一，担心Triton或SDS的影响，我们用去垢剂兼容性的Bradford试剂即可。第二，担心标准曲线不佳，我们用二项式来拟合即可。

下面我们继续利用excel的自动化功能进一步提升计算速度。首先，初中的时候大家就学过，解二项式的公式是：

这条曲线是一条开口向下的抛物线，所以取x轴上的较小的值就是我们所要的浓度值。为了简单易用，我们可以先命名几个单元格为background，a，b，c，从酶标仪读取OD值之后填入background，复制标准曲线的光密度值，填入excel给出的方程中的a，b，c之后，excel就能自动减去背景计算出浓度了。

整个过程熟练的话1分钟足矣，首次操作的同学2分钟也就足够了。俗话说好马配好鞍，快速WB需得配合快速蛋白定量方能有一气呵成、唯快不破的痛快淋漓。但是，使用这种方法需要注意的几个问题：

注意要点

1.蛋白浓度不能太高，如果超过了标准曲线的范围（比如OD2），那就测量不准了。不仅是本方法，所有基于浓度标准曲线的方法都是如此，比如ELISA。当然也不能太低了。

2.大约10年前就有文献报道测量双波长，即A和A的比值能够获得良好的线性关系并提高灵敏度，这种方法我试过了，在0.-1.5mg/ml的范围内准确性不如二项式曲线拟合高。

3.另外，标准品有可能发生降解导致浓度不准确，建议每次测量时加入一个已知浓度的样本作为校验。我每次都会加入一个0.1-0.5mg/ml的BSA标准品，校验一下曲线是否准确。

4.加入标准品的时候枪头一定不能有残留，否则容易引起较大误差，建议初学者刚开始时做2到3个标准品复孔。

5.Bradford法加完样之后需立刻马上测量，OD值能稳定保持10分钟左右，如果不能马上测量，建议换用BCA法。

6.终极大招：如果你已经是老司机了，还有个方法不用测蛋白浓度，只要在显微镜下估测各组细胞密度差不多，直接提蛋白变性上样跑WB即可。但老司机也有翻车的时候，请慎用。

好了，今天就写到这里吧，你们要的excel模板（BCA和Bradford法都有）毛老师已经给你们准备好了，生物学霸后台回复excel即可下载。