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理论计算揭示XimE环化酶催化的二分特性
摘要
长期以来，酶的特征在于它们在将一种底物催化为一种产物方面的特异性和效率。然而，最初在厦门霉素生物合成中发现的类SnoaL环化酶（XimE）不仅催化XimD产生的天然环氧化物代谢物的吡喃形成环化，而且增强非天然环氧化物异构体的呋喃形成环化。本文通过理论酶（theozyme）-簇模型）、分子动力学(MD)模拟、ONIOM(ωB97X-D/6-31G(d)：AMBER)过渡态搜索计算和QM/SCRF(VS)介电常数扫描阐明了XimE中独特的底物控制酶功能的反应机制:
吡喃和呋喃途径具有相似的一般酸碱催化机制，其中E和H分别充当质子供体和受体；吡喃由通过酸催化模式的fused-TS产生，而呋喃通过由碱催化模式spiro-TS产生。ONIOM计算发现四种可能的过渡态的相对能量为Fused-S?Spiro-SSpiro-RFused-R。XimE催化从S-环氧化物形成吡喃和从R-环氧化物形成呋喃的区域化学偏好源于酶与其过渡态之间的诱导拟合相互作用，这种相互作用会延续到产物中。
背景介绍
催化混杂和底物歧义是酶进化的关键，是生物合成和生物催化的进化起点。在厦门链霉菌的厦门霉素生物合成中，3-色素醇厦门霉素B的吡喃环是通过FAD依赖性氧化还原酶(XimD)对烯烃前体3-香叶基-4-羟基苯甲酸酯的S-环氧化形成的。这种S-环氧化物被类SnoaL环氧化物水解酶(XimE)通过环氧化物开环转化为吡喃。XimeE的底物混杂性已被广泛研究，包括芳环上的卤素和羟基取代、苯甲酸酯和其他苯并杂环化合物，如7-去甲基硬木红素和osthenol。XimD和XimE的级联组合使吡喃香豆素与呋喃香豆素的比例高达50:1。XimE还可以催化对映体R-环氧化物转化为呋喃产物。相比之下，在水性缓冲液中自发的环氧化物开环反应会产生pH4和pH8之间的呋喃和吡喃产物的混合物；吡喃香豆素产品在酸性条件下占主导地位，而呋喃香豆素产品在碱性条件下占主导地位。XimE显着增强S-环氧化物底物的吡喃香豆素和R-环氧化物的呋喃香豆素的形成。
单位与作者
通讯作者
上海交通大学:赵一雷教授，徐岷涓教授
美国加州大学洛杉矶分校（UCLA）K.N.Houk教授
第一作者
蒋础础
计算结构和模型
XimE的晶体结构(PDBID:3ISL,3ISK)
计算软件和方法
分子动力学模拟：Amber18
模拟轨迹分析：CPPTRAJ模块
QM/MM计算：ONIOM方法，Gaussian16
预反应态：PrereactionState(PRS)Analysis
团簇理论酶模型：ClusterTheozymeModels
研究亮点
课题组通过理论酶簇模型、预反应态和后反应态MD模拟、ONIOM过渡态计算和QM/SCRF(VS)介电常数扫描阐明了XimE中独特的底物控制酶功能的反应机制。两条催化途径具有类似的广义酸碱催化机制，皆由E和H分别充当质子供体和受体，融合型过渡态合成吡喃产物而螺型过渡态则合成呋喃产物。其催化的区域选择性源自酶与两种过渡态之间的诱导契合作用，这种底物-酶的相互作用可以延续到酶-产物复合物中，控制了不同产物的催化效率。XimE显然与上游XimD环氧化物酶产生的天然S-环氧化物底物一起进化，偶然地通过相近的广义酸碱催化机制催化对映体R-环氧化物的另一类环化反应。
研究结果
研究人员首先发现环氧化物的尾部深入疏水口袋中，苯甲酸盐的头部位于亲水区域。催化三联体E–H–Y46中的E–Y46和H分别位于两侧。由于酸催化的活化能垒（12.2kcal/mol）要远低于碱催化的活化能垒（18.8kcal/mol），质子供体的作用可能是酶催化的主要因素。因此相比于H，中性的二联体E-Y46更可能作为环氧氧原子的质子供体。研究人员使用R-和S-环氧化物的双阴离子形式来寻找过渡结构的预反应状态（分子中的E、H和Y46均呈酸性形式），然后再应用QM/MM方法确定XimE催化的环氧化物开环反应中的质子供体和受体。
图1：XimE中的合理取向：分别展示了厦门霉素B的由内而外的视图，（中）XimE共晶结构，（中）活性口袋处的放大视图，以及可能的酸碱催化S-和R-环氧化物底物，它们受到外部亲水性苯甲酸盐部分和内部疏水尾部的限制，并在其主要途径中与E-Y46（供体）-H（受体）催化相匹配。图片来源ACSCatalysis
MD模拟和预反应态分析
随后研究人员进行了分子动力学模拟，进行了结合自由能计算和预反应态分析，发现fused-Sandspiro-R的体系中形成了稳定的氢键作用，在近进攻构象（NAC）占比分别达到了66.5%和83.4%，但spiro-S和fused-R体系中对应的比率降低至2.2%and2.1%。巨大差异的原因可以追溯为spiro-S体系中H的Nε原子和环氧基的O原子，以及E的Oε原子和苯氧基的O原子形成的非协同的氢键；fused-R体系中缺乏稳定的E的Oε原子与苯氧基的O原子的相互作用，预反应态和相互作用分析表明spiro-S和fused-R体系不利于形成环氧基开环的产物，这和XimE主要将S-环氧化物底物转化吡喃产物的实验观察结果非常一致。
图2:预反应态分析：(A)残基水平的结合能分解。蓝色表示吸引；红色表示排斥。(B)使用3?阈值作为氢键供体和受体的近攻击构象的统计分布。图片来源ACSCatalysis
QM/MM计算
研究人员随后进行了QM/MM计算，用ONIOM方法在ωB97X-D/6-31+G(d):AMBER)水平进行计算，重点