摘要：目的观察温阳泄浊通络法对5/6肾切除所致慢性肾衰竭大鼠肾间质纤维化的干预作用，并探讨其机制。方法32只SD大鼠随机选取8只为假手术组，其余24只行5/6肾切除术制备肾纤维化模型。造模完成后随机分为模型组、温阳泄浊通络法组、尿*清组，并ig予以相应药物。干预12周后，取肾组织，行HE、PAS染色检测病理损伤程度，行Masson、天狼星红染色检测纤维化程度，并应用免疫荧光、Westernblotting法检测I型胶原蛋白及mRNA的表达，应用免疫组化、Westernblotting法检测肾小管上皮细胞EMT相关蛋白（α-SMA、Vimentin、E-cadherin）的表达。结果与模型组比较，温阳泄浊通络法可减轻肾脏病理损伤及肾纤维化程度，并显著降低I型胶原蛋白及mRNA的表达；下调α-SMA、Vimentin的高表达，上调E-cadherin的低表达。结论温阳泄浊通络法可有效减轻慢性肾衰竭大鼠肾损伤、改善肾纤维化，其机制可能与抑制肾小管上皮细胞EMT及I型胶原的表达相关。
慢性肾衰竭（CRF）是在各种慢性肾脏病的基础上缓慢出现肾功能进行性减退直至衰竭的一种临床综合征[1]。其主要病理改变为肾小球硬化和肾间质纤维化，是各种原因的慢性肾脏病进展至终末期肾病（ESRD）的主要病理基础。以往人们注重肾小球硬化的研究，但近年来大量研究表明，与肾小球硬化相比，肾间质纤维化更易导致ESRD的发生，对患者的预后有决定作用[2-3]，并且肾小管上皮细胞间充质转分化（EMT）是导致肾间质纤维化的关键因素之一，在肾间质纤维化的发生发展中发挥着重要作用[4-6]。
从中医角度分析，本课题组认为CRF的主体病机为脾肾阳虚、湿浊内停、瘀血阻络，治宜益气温阳、祛湿泄浊、化瘀通络，因此温阳泄浊通络法为其基本治法[7-9]。该法已应用于临床多年，疗效确切[10]。为进一步明确温阳泄浊通络法的作用靶点和可能的作用途径，开展温阳泄浊通络法对慢性肾衰竭大鼠肾间质纤维化的干预作用实验研究，以期为其临床推广应用提供实验依据。
1材料
1.1实验动物
清洁级雄性SD大鼠，体质量～g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）-。
1.2药物
温阳泄浊通络法所用药物为颗粒剂，由广东一方制药有限公司生产，1g颗粒相当于7g饮片，具体组方规格如下：*芪（批号）30g、当归（批号）15g、川芎（批号904001）12g、红花（批号）10g、地龙（批号61）12g、水蛭（批号1082）6g、仙茅（批号601）12g、仙灵脾（批号703）15g、藿香（批号）10g，佩兰（批号）10g、陈皮（批号）15g、白豆蔻（批号20）10g、土茯苓（批号）30g、积雪草（批号）30g；尿*清颗粒（5g/袋，批号）由康臣药业（内蒙古）有限责任公司生产。
1.3主要试剂
抗GAPDH抗体（武汉赛维尔生物科技有限公司）；抗α-SMA抗体（杭州华安生物技术有限公司）；抗E-cadherin抗体（GeneTex）；抗CollagenI抗体（AffinityBiosciences）；抗Vimentin抗体（Abcam）；兔SP试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；BCA法蛋白定量试剂盒（杭州联科生物技术有限公司）；TrizolReagent（LifeTechnologies公司）；FastQuantcDNA第一链合成试剂盒（Thermo公司）；FastStartUniversalSYBRGreenMaster（Roche公司）；引物（武汉赛维尔生物科技有限公司）。
1.4仪器
NanoDrop0C紫外分光光度计（Thermo公司）；荧光定量PCR仪（ABI）；BX63＋DP72正置研究级显微镜（Olympus公司）；酶标仪（MolecularDevices公司）；Odyssey红外激光扫描仪（LI-COR）；倒置荧光显微镜（Nikon公司）。
2方法
2.1动物分组、造模及给药
32只大鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法分为假手术组（8只）和造模组（24只）。假手术组仅接受腹部切开、剥离肾包膜操作，肾实质无损伤。造模组大鼠首次切除左肾上下级共约2/3左肾，1周后切除全部右肾，2次共切除约5/6肾。造模完成后，造模组随机分为模型组、温阳泄浊通络法组、尿*清组。温阳泄浊通络法组及尿*清组分别ig给予温阳泄浊通络颗粒（3.24g/kg）及尿*清颗粒（2.25g/kg），药物剂量均根据成人临床剂量按照体表面积法计算；假手术组及模型组ig相应体积的生理盐水，每日1次，连续给药12周。
2.2观察指标及检测方法
2.2.1肾脏组织病理染色观察肾脏组织经4%多聚甲醛溶液固定48h后，脱水、透明、浸蜡、包埋，制成3μm石蜡切片，按常规方法行HE、PAS、Masson、天狼星红染色，显微镜下观察其改变并采集图像。
2.2.2免疫组织化学法检测肾脏α-SMA、E-cadherin及Vimentin蛋白的表达石蜡切片脱蜡水化后，经微波修复抗原、3%H2O2阻断内源过氧化物酶、血清封闭后，一抗（α-SMA1∶、E-cadherin1∶、Vimentin1∶）孵育过夜滴加HRP标记的二抗，显微镜下DAB显色，复染，封片，拍照观察。
2.2.3免疫荧光法检测I型胶原蛋白的表达石蜡切片脱蜡至水，经抗原修复、自发荧光淬灭后，依次滴加一抗（I型胶原1∶）、二抗，DAPI复染细胞核后封片，镜检拍照。
2.2.4Westernblotting法检测α-SMA、E-cadherin、Vimentin及I型胶原蛋白的表达以裂解液（含蛋白酶抑制剂）提取冰冻肾组织蛋白质，并用BCA法测定其含量。后经5×上样缓冲液稀释后，95℃变性5min。蛋白上样量为20～40μg。经电泳、转膜、牛奶封闭、一抗（α-SMA1∶0、E-cadherin1∶0、Vimentin1∶0、I型胶原1∶0、GAPDH1∶0）孵育过夜、荧光二抗孵育后，TBST清洗显影。用ImageJ软件分析其灰度值，并以目的蛋白与GAPDH灰度值的比值表示蛋白相对表达量。
2.2.5实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测肾脏I型胶原mRNA的表达Trizol法提取RNA，反转录cDNA，按照试剂盒说明进行荧光定量操作。I型胶原上游引物序列：5’-AGAGGCATAAAGGGT-CATCGTG-3’，下游引物序列：5’-AGACCGTTGA-GTCCATCTTTGC-3’，引物长度bp。每个样本设3个复孔，采用2?ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。
2.3统计学方法
数据资料以表示，使用SPSS21.0进行统计学处理，方差齐采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验；方差不齐采用秩和检验，组间比较采用Mann-Whiteney法。
3结果
3.1各组大鼠肾组织形态学改变
各组大鼠肾组织HE染色及PAS染色结果（图1）显示，假手术组未见明显病理改变；模型组可见系膜细胞及基质增生，肾小球节段性硬化，肾小管颗粒空泡变性，局灶状萎缩，肾间质局灶状纤维化伴大量淋巴单核细胞浸润，小动脉壁增厚，管腔狭窄。与模型组相比，温阳泄浊通络法组及尿*清组肾脏损伤程度明显减轻。
3.2各组大鼠肾纤维化程度的比较
各组大鼠肾组织均Masson染色及天狼星红染色结果（图2）皆显示，假手术组可见少量纤维沉积，而模型组有大量的胶原沉积于肾间质中，且温阳泄浊通络法组及尿*清组胶原纤维沉积较模型组明显减少。
3.3各组大鼠肾组织I型胶原蛋白及mRNA表达量的比较
免疫荧光结果（图3）显示，假手术组仅在肾间质有少量I型胶原蛋白的沉积，而模型组在肾小管间质有大量I型胶原蛋白的沉积，且温阳泄浊通络法组及尿*清组I型胶原蛋白的沉积较模型组明显减少。
Westernblotting结果（图3）显示，与假手术组比较，模型组大鼠I型胶原蛋白的表达量明显增多（P＜0.05）；与模型组比较，温阳泄浊通络法组及尿*清组I型胶原蛋白的表达量明显减少（P＜0.05），但两组之间I型胶原蛋白的表达量无明显差异。
qRT-PCR结果（图3）显示，与假手术组比较，模型组大鼠I型胶原蛋白mRNA的表达量明显增多（P＜0.05）；与模型组比较，温阳泄浊通络法组及尿*清组I型胶原蛋白mRNA的表达量明显减少（P＜0.05）；与尿*清组相比，温阳泄浊通络法组I型胶原蛋白mRNA下降更为明显。
3.4各组大鼠肾组织α-SMA、E-cadherin及Vimentin蛋白表达量的比较
免疫组化结果（图4）显示，与假手术组比较，模型组大鼠α-SMA及Vimentin蛋白表达量明显增多，E-cadherin蛋白表达量明显减少；与模型组比较，温阳泄浊通络法组及尿*清组α-SMA及Vimentin蛋白表达量均明显减少，而E-cadherin蛋白表达量均有所提高。
Westernblotting结果（图5）显示，与假手术组比较，模型组大鼠α-SMA及Vimentin蛋白的表达量明显增多（P＜0.05）；与模型组比较，温阳泄浊通络法组及尿*清组α-SMA及Vimentin蛋白的表达量均明显减少（P＜0.05），但两组之间α-SMA及Vimentin蛋白的表达量均无明显差异。与假手术组比较，模型组大鼠E-cadherin蛋白的表达量明显减少（P＜0.05）；与模型组比较，温阳泄浊通络法组及尿*清组E-cadherin蛋白的表达量均有所提高（P＜0.05），但两组之间无明显差异。
4讨论
以CRF的发病机制、病理改变及临床特征为依据，结合临床实践，运用中医理论分析，本课题组认为CRF的主体病机为脾肾阳虚、湿浊内停、瘀血阻络。CRF早期以脾肾气虚为发病起始，气虚日久则阳虚为甚。肾主水，脾主运化水液，脾肾亏虚则运化不及，升清降浊功能失常，致湿浊内停，壅滞三焦。湿浊之邪易阻碍气机，使气血运行不畅，加之“久病必瘀”，使瘀血贯穿疾病始终。因此提出益气温阳、祛湿泄浊、化瘀通络为CRF的基本治法，简称温阳泄浊通络法。本实验所用温阳泄浊通络颗粒共有14味中药组成。其中，*芪、仙茅、仙灵脾益气温阳，鼓动全身气机，以助气化；当归、川芎、红花活血化瘀，并佐以虫类搜剔之品地龙、水蛭，使络脉得通，瘀滞尽去。此外，根据三焦的功能特性及湿浊的致病特点，提出了三焦分消、祛湿泄浊法，包括上焦如雾，宜宣宜散，应用藿香、佩兰以宣散上焦湿邪；中焦如沤，宜运宜化，应用陈皮、白豆蔻以运化中焦湿浊；下焦如渎，宜渗宜利，应用土茯苓、积雪草以渗利下焦湿浊。诸药合用，共奏益气温阳、祛湿泄浊、活血化瘀通络之效。本实验证实温阳泄浊通络法可明显减轻CRF大鼠的肾脏病理损伤程度。
CRF的主要病理改变为肾纤维化，包括肾小球硬化和肾间质纤维化。其中肾间质纤维化与肾功能损害程度及患者预后密切相关，因此成为目前的研究热点。肾间质纤维化形成的主要环节为细胞外基质的大量沉积[11]，而I型胶原为细胞外基质的主要成分，在肾纤维化的发生发展中发挥重要作用[12]。另有文献证实，在各种慢性肾脏病中，受损伤的肾小管上皮细胞可通过EMT转化为肌成纤维细胞，同时引起成纤维细胞及其他肌成纤维细胞的聚集，导致细胞外基质的大量合成和分泌，形成肾纤维化，加速疾病的进展[13-14]。肾小管上皮细胞EMT的特点为上皮细胞标志蛋白E-cadherin的表达减少及间充质细胞标志蛋白α-SMA、Vimentin等的表达增加[15-16]。本实验证实温阳泄浊通络法可显著改善CRF大鼠肾间质纤维化的程度；抑制I型胶原蛋白的表达；并可通过上调E-cadherin的低表达、下调α-SMA、Vimentin的高表达，从而抑制肾小管上皮细胞EMT。
综上所述，温阳泄浊通络法可改善肾损伤及肾间质纤维化，其机制可能与抑制I型胶原的表达及调控肾小管上皮细胞EMT相关。
参考文献（略）
来源：张学琴，方敬，赵炳武，吴苏，潘永梅，陈志强.温阳泄浊通络法对慢性肾衰竭大鼠肾间质纤维化的干预作用及其机制研究[J].中草药,,50(9):-.
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