摘要：吕宋肽菌素和相关的十肽是双嵌入非核糖体多肽，具有对其生物活性至关重要且罕见的酰基取代4-羟基-2,3,4,5-四氢哒嗪-3-羧酸(Thp)单元。在此，作者通过体内遗传学和体外生化方法重建了吕宋肽菌素的生物合成修饰路径。值得注意的是，作者揭示了一个多功能细胞色素P酶，它催化四个连续的氧化反应，包括非常不寻常的C-N键脱氢反应，形成含腙的4-OH-Thp残基。此外，作者还发现了一种膜结合的酰基转移酶，该酶可能介导随后的胞外O-乙酰化，作为一种对生产菌株潜在的自我保护策略。对新型十肽和相关P酶的进一步基因组挖掘，为P介导的C-N去饱和反应提供了机制见解。该研究结果不仅揭示了双嵌入十肽形成药效团的分子基础，而且扩大了P家族酶的催化功能。
杂志名：AngewandteChemieInternationalEditionDOI：10./anie.
英文题目：AntitumorAgentsEnzymaticTailoringinLuzopeptinBiosynthesisInvolvesCytochromeP-MediatedCarbon–NitrogenBondDesaturationforHydrazoneFormation
作者：XinjieShi,LimingHuang,KaihuiSong,GuiyunZhao,YuLiu,LongxianLv,andYi-LingDu
单位：浙江大学基础医学院
图1：选择双嵌十肽的例子和luzopeptin生物合成的体内遗传研究。A)luzopeptins和相关的十肽的结构。特征取代的含腙杂环以红色突出显示。B)luzopeptins的生物合成基因簇。C)马杜拉放线菌DSM及其遗传突变体代谢提取物的HPLC分析(检测波长=nm)。
双嵌入型十肽是一组具有C2对称性大环骨架结构的非核糖体肽(NRP)。它们能以一定的构象嵌入到DNA双螺旋相邻的两个小沟中，产生良好的抗菌、抗肿瘤、抗病*活性。
作为十肽类的代表吕宋肽菌素（luzopeptins，1）其抗肿瘤活性约为化疗药物丝裂霉素C的-倍。吕宋肽菌素和相关的korkormicins和quinoxapeptin具有一个不同寻常的四氢哒嗪部分的环状亚氨基酸结构单元(图1A)。乙酰化修饰的4-羟基-2,3,4,5-四氢哒嗪-3-羧酸（4-OH-Thp）的结构单元对吕宋肽菌素生物活性起决定性作用。虽然酰基化含腙的Thp残基是一个关键的药效基因，但其生物合成机制尚不完全清楚。在这里，作者研究了luzopeptinA的生物合成途径，并重建了形成其关键药效团的酶序列并进一步揭示了luzopeptin中罕见的p介导的碳氮双键形成的机制。为了找到Luzopeptins和Korkormicins的生物合成基因簇，作者首先对其生产菌马杜拉放线菌和小单孢菌进行了基因组测序，基于双嵌入型八肽(包括echinomycin和thiocoraline)建立的生化逻辑，找到了Luzopeptins和Korkormicins的可能生物合成基因簇(BGCs)（图1B），这个BGC都含有ktzI-ktzT的同源基因luz17-luz13/kor17-kor13，表明luzopeptinins/korkormicins中Thp可能是通过哌嗪基中间体形成的。为了确定luzBGC参与luzopeptins的生物合成，基因敲除了假定的哌嗪合成基因luz13，HPLC结果显示没有产生1，产生了4和5（图1C），其中4是1的发色团，表明该基因簇与1的合成有关联。
图2：luzopeptin同族物的体内遗传学研究和luzopeptin生物合成中调控步骤的体外重建。A)基因突变体中luzopeptin同源基因的结构。B)Luz26与6的体外反应混合物的HPLC分析C)Luz26与8的体外反应混合物的HPLC分析。D)Luz26与9的体外反应混合物的HPLC分析。E)3与含有Luz27的膜组的体外反应混合物的HPLC分析。F)Luz26和Luz27构建4-乙酰氧基-Thp亚基。然后，作者集中研究了可能参与构建特征o-乙酰化4-OH-Thp残基的基因。其中包括两个推测的细胞色素P基因luz25和luz26，以及一个推测的酰基转移酶基因luz27(表S1)。通过基因敲除luz25、luz26和luz27，并对它们各自的突变体进行了代谢分析(图1C)。结果表明Luz26可能参与了哌嗪残基(或作为游离氨基酸)转化为含有腙的4-OH-Thp。为了确定Luz26在6到3的转化过程中具体的作用，以及探索这种转化是否需要额外的酶(s)，作者在体外重建Luz26催化的反应。表明Luz26本身就足以催化连续四步的氧化反应，将6转化为3(图2B)，还可以催化8和9转化为3(图2C,D)。除3，从Dluz27中还分离出少量成分8和9(图1C)。对luz27进行生物信息学分析，可能为乙酰基转移酶。作者从表达luz27的S.albusJ制备膜组分，并在存在乙酰辅酶A的情况下将其与3一起孵育。HPLC显示了反应混合物中有1和2的生成(图2D)。这些结果表明，整合膜酰基转移酶Luz27以乙酰辅酶a为乙酰供体，催化3中4-OH-thp残基的4-OH-乙酰化反应生成1(图2E)。接下来作者转向另一个P基因luz25。通过基因敲除luz25，1的产量降低，还有10-17化合物的产生（图2A），作者将Luz25定位为P羟化酶，在该位点上羟基。
图3.基于本研究提出的luzopeptinA(1)生物合成途径。注：R组与图1A中显示的相同。基于上述遗传学和生化研究，作者提出了一种用于生物合成1的酶促修饰途径（图3）。Luz2的硫酯酶结构域在肽链组装和头对尾二聚化后释放的新生产物可以首先由Luz25加工生成6，然后由Luz26进行四次连续氧化，得到3。最后步骤涉及通过整合膜酰基转移酶Luz27在3的4-OH-Thp残基处进行细胞外O-乙酰化。
图4。新型十肽jiangxipeptin的基因组挖掘及P酶JxpK的鉴定。A)jiangxipeptin的结构(18-20)。B)18的x射线晶体结构。C)luzonensis菌株Dluz26+jxpK新化合物21和22的结构。D)JxpK与6孵育3h后的体外反应混合物的LC-MS分析显示生成22。E)推测的Luz26/jxpk催化C=N键形成的机理。这里的R基团可以是-OH或者-H。另外，鉴于C-N键的去饱和反应对于P家族来说是非常稀有的反应类型，研究者进一步对其催化机理进行了探究。通过以P酶Luz26为指导的数据库挖掘，研究者在江西伦茨氏菌（Lentzeajiangxiensis）找到了含有Luz26同源基因的基因簇，通过培养该菌分离到3个新的含哌啶酸结构单元的jiangxipeptinsA–C(18–20)(图4A).。
为了探究同源基因JxpK的功能，作者将JxpK导入到Dluz26突变体中，检测到两种新产物21和22(图4C)。进一步发现JxpK能在体外转化6到22(图4D)。结果揭示了Luz26催化的C-N去饱和反应可能是先羟化后脱水的催化机理。然而，不能排除通过直接第二次夺氢形成C=N键的可能性（图4E）。
结论：在这里，我们研究了双嵌入十肽luzopeptinA生物合成中的酶促修饰途径，并揭示了其药效团形成的生化基础。尽管P酶表现出无与伦比的催化多样性，但该家族酶的碳氮键去饱和极为罕见。Luz26催化C=N键的形成，导致从肼中间体形成腙，扩大了这些非凡的血红蛋白的催化功能。此外，作者揭示了一种催化跨膜酰基转移反应的整合膜酰基转移酶Luz27，可能代表luzopeptin生产者的潜在自我保护策略。此外，作者还鉴定了新的双嵌入BGC，包括luzopeptins、korkormicins、jiangxieptins和Sandramycin，极大地丰富了组合生物合成的遗传工具箱，以产生具有治疗潜力的衍生物。
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