大家好，今天和大家分享一篇年发表在LANGMUIR上的一篇题为RigidDouble-StrandedDNALinkersforSingleMoleculeEnzyme?DrugInteractionMeasurementsUsingMolecularRecognitionForceSpectroscopy的文章，通讯作者是来自爱荷华大学的AmnonKohenA教授和lexeiV.Tivanski教授。
酶调节所有的生物的代谢途径，它的选择性抑制是许多疾病药物开发的常用方法。对酶-药物相互作用的认识可以极大促进合理的药物设计。单分子力谱是原子力显微镜（AFM）的应用之一，分别在基板和AFM针尖共价修饰上配体与受体分子，可以定量测量二者之间的相互作用强度。然而在进行AFM实验过程中，使用柔性linker可能会掩盖配体的活性位点，降低实验效率。在这篇文章中，作者使用dsDNA作为刚性linker将酶固定在基板上，空间定位感兴趣的分子，用单分子力谱测量该酶与药物的相互作用。作者选用大肠杆菌二氢叶酸还原酶（DHFR）和其结合抑制剂甲氨蝶呤（MTX）作为本次研究的系统。
图1.溶液中云母表面dsDNA高度图像。
作者用共价修饰的方法将dsDNA固定在云母和针尖表面，并用AFM成像评估云母表面的dsDNA覆盖程度及其方向。高度图像显示，云母表面包含多个高度约为40nm，半峰宽约为nm的柱状凸起以及一些高度小于10nm的颗粒状凸起。40nm的柱状高度与所用DNA长度相当，nm的宽度预示着这些dsDNA在云母表面以簇状形式存在，而小于10nm的颗粒，可能是修饰过程中DMSO和乙醇胺聚合或少量dsDNA聚合吸附在云母上的结果。DNA游离端带有的巯基再与DHFR活性位点背面的半胱氨酸反应，使DHFR的活性位点暴露在云母表面，用于MTX的识别，实现DHFR在空间方向上的固定。
图2.不同连接情况下的AFM实验
Amnon和lexei教授研究了五种不同连接情况下的AFM实验（如图2）。上图中，（A）MTX直接连接到AFM针尖和DHFR直接连接到云母上，（B）MTX通过PEG连接到AFM针尖和DHFR直接连接在云母上，（C）MTX直接连接AFM针尖和DHFR通过刚性dsDNA连接到云母表面，（D）MTX通过PEG连接到AFM针尖，DHFR通过刚性dsDNA连接到云母表面，（E）MTX通过刚性dsDNA连接到AFM针尖和DHFR通过刚性dsDNA连接到云母表面。上图中左边只显示AFM的retract曲线，蓝色和红色分别代表DHFR被MTX阻断前后，黑色实线表示高斯拟合。
表1.MTX阻断之前和之后测量的不同连接情况(A-E)中MTX和DHFR之间最可能的断裂距离、单个力图的总数和最可能的断裂力
表1显示了五种连接情况下MTX阻断前后，MTX和DHFR之间断裂距离和断裂力的测量结果。在DHFR被MTX阻断之前，非特异性的相互作用总是具有较短的断裂距离，对于C-E，MTX和DHFR的相互作用在距离云母较远的表面发生断裂，针尖和基板表面非特异性的相互作用显著降低。这些断裂距离中，伴随着DHFR的部分解折叠，但具体解折叠程度是未知的。DHFR解折叠全长为65nm左右，以上的断裂距离显示，DHFR并没有完全解折叠。例如B，30nm的断裂长度，对应于PEG（约24nm）的长度加酶的大小（约4nm）以及酶的部分解折叠。
一旦DHFR的活性位点被阻断之后，对于所有连接情况，只有非特异性相互作用断裂发生在较短距离，力相较于特异性的相互作用显著降低。
图3.MTX阻断之前（蓝色圆圈）和之后（红色方块）的最可能破裂力和标准偏差的比较。
非特异性力分布（红色）具有较低的力值，但它与活性位点特异性断裂（蓝色）中DHFR-MTX的力分布有不同程度的重叠。这种重叠在A中最大，在D和E中显着减少，与特定破裂力量化相关的标准偏差也从A到E降低，表明前者的状态分布更广泛。在A和C（MTX直接结合在AFM针尖上）中，断裂力分布的宽度可能反映多个酶和MTX分子的多个解离事件。
最后，作者将DHFR换成叶酸（FA）进行试验，针尖和基板上都用dsDNA作为linker，特异性的相互作用和非特异相互作用也可以很好的分开（如图3E-FA）。由此可以看出，以dsDNA作为刚性linker用于测量和比较各种配体和蛋白质之间的特定解结合相互作用，具有单分子水平研究的潜力。
综上所述，这篇文章表明，在AFM实验中，利用dsDNA作为linker与用PEG作为linker都会减少与基板的非特异性相互作用，柔性linkerPEG可能会使蛋白质的活性位点与表面接触，导致它们的粘附和变性或者是活性位点的堵塞。而dsDNA具有更大的刚性，允许在基板表面相对快速的空间定位固定化酶分子，这种方法也适用于研究多种类型的非酶促或者生物受体-配体系统。
王梦蝶
郑鹏课题组级硕士生