（一）、基本操作流程
方法一双抗体夹心法（用于检测未知抗原的）
1.包被：用包被液将抗体稀释至蛋白质含量为0.5～20μg／ml，按ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜。
2.洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约-ul/孔），漂洗2-3次，每次3-5min；
3.?封闭：按-ul/孔加入封闭液，室温2-3小时或37℃1-2小时，也可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液；
4.?样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品(含未知抗原)稀释至所需浓度；
5.标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤）；
6.加样：按排列顺序依次加入50-ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品、阴性对照及阳性对照，室温或37℃孵育30-60min；
7.?洗板：同步骤2；
8.加酶标抗体：酶标抗体的稀释按产品说明书，按50-ul/孔加入新鲜配制的酶标抗体，室温或37℃孵育1小时；
9.?洗板：同步骤2；
10.?加底物液显色：按-ul/孔加入新配制的TMB底物溶液，室温避光反应15～30分钟。
11.?终止反应：于各反应孔中加入50ul的终止液。
12.?结果判定：可于白色背景上，直接用裸眼观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可在酶标仪上于nm(若以ABTS显色，则nm)处测OD值。检测时以空白对照孔调零后测各孔OD值，若样品孔中的OD值大于阴性对照孔的2.1倍，即为阳性。
2?方法二?间接法（用于检测未知抗体）??????
1.??包被：用包被缓冲液将已知抗原稀释至0.5～20μg／ml，按ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜，次日洗涤2-3次；??????????
2.?洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约-ul/孔），漂洗2-3次，每次3-5min；??????
3.??封闭：按-ul/孔加入封闭液，室温2-3小时或37℃1-2小时，也可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液；??????
4.??样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品稀释致所需浓度；???????
5.?标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤）；????
6.?加样：按排列顺序依次加入50-ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品(含未知抗体),阴性对照及阳性对照，室温或37℃孵育30-60min；??????????
7.??洗板：同步骤2；?????????
8.?加酶标抗体：按50-ul/孔加入新配制的酶标抗体（抗抗体），室温或37℃孵育1小时；酶标抗体的稀释按产品说明书；?????
9.??洗板：同步骤2；???????
10.?加底物液显色：按-ul/孔加入新配制的TMB底物溶液，室温避光反应15～30分钟。????
11.?终止反应：于各反应孔中加入50ul的终止液。????
12.?结果判定：裸眼观察结果或用酶标仪测OD值，有色产物的生成量＝抗体量。???
(二)?、ELISA常用的四种方法??????
1．直接法测定抗原?????????
将抗原吸附在载体表面；????????
加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物；????????
加入底物；????????
结果判定：有色产物的生成量＝抗原量。?????
2．间接法测定抗体????????
将抗原吸附于固相载体表面；????????
加待检抗体,?形成抗原-抗体复合物；????????
加酶标抗体（抗抗体）；?
?加入底物；????????
结果判定：有色产物的生成量＝抗体量。??????
3．双抗体夹心法测定抗原????????
将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;????????
加抗原，形成抗原-抗体复合物;?????????
加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物;????????
加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体);?????????
加入底物；????????
结果判定：有色产物的生成量＝抗原量。?????
4．?竞争法测定抗原????????
将抗体吸附在固相载体表面;????????
加入酶标抗原和待测抗原；????????
加入底物；?????????
结果判定：对照孔与样品孔有色产物的生成量的差与未知抗原的量成负相关。?????????????????????????????????????????????????????????????
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