AusE和PrhA都以对称的同源二聚体存在，具有典型的非血红素铁加氧酶的折叠类型。这些酶有一个?2的紧密二聚体界面，并形成了一个漏斗状的活性口袋。AusE和PrhA的单体结构高度相似(个Cα叠加的RMSD0.6?)。AusE和PrhA拥有保守的αKG加氧酶家族中金属结合所需的2-His-1Asp催化三联体(His-Asp-His)，在AusE-Mn和PrhA-Fe结构中，催化三联体结合金属离子(图2a中L区域)。在PrhA-Fe/αKG和PrhA-Fe/αKG/5结构中，αKG、催化三联体和1个水分子形成八面体结构。αKG以双齿方式螯合铁，并通过盐桥和氢键网络与Arg72、Gln、Thr及Arg相互作用。二聚体中只有PrhA的B链的活性位点结合了底物5，5位于被Fe(IV)=O氧化的朝向。5的分子结构与之前报道的结构一致，但其A环构象发生了变化，即，与PrhA结合时，5的A环从椅型构象转变为船型构象，这种构象变化可能对起始时Fe(IV)-oxo抓取氢原子比较重要。在PrhA-Fe/αKG/5结构中，5通过氢键网络固定在His-Asp-His三联体相对于Fe(II)中心的对面(图2b)。此外，LoopA的57-69位残基(LoopA)和A链C端的发夹结构’-’位残基(HairpinB)也参与到底物结合之中(图2a中的B区)，Asp与5的D环形成氢键。PrhA-Fe/αKG/5中A链和B链的叠加表明作为lid的LoopA构象发生显著变化：在结合5后，B链的A环从开放到闭合状态切换向底物移动，A环上Ser66的Cα向活性位点移动5.4?，与Asp’和底物5的D环相互作用，这种从开放到关闭状态的切换保护活性中间体不受溶剂的影响。有趣的是，5的D环也与αKG直接作用(3.1?)，意味着底物结合需要与αKG-5接触。由于αKG在每个反应周期中被消耗，氧化产物也可能与琥珀酸一起离开活性位点，底物在新的αKG分子结合后重新进入活性中心。
图2．AusE-Mn/αKG和PrhA-Fe/αKG/5的活性口袋结构a）PrhA-Fe/αKG/5活性口袋中结合Fe和5的残基，分为三个区域；b）AusE-Mn/αKG和PrhA-Fe/αKG/5的活性口袋的叠加比较。其中、、和位残基不保守。二、点突变实现功能转换AusE和PrhA的结构比较表明R区三个残基不保守：、和(图2b)。考虑到AusE和PrhA的结构决定它们催化相同底物发生不同反应，研究人员将PrhA中可能与5的A环相互作用的两个残基(Val和Ala)与AusE对应的残基(Leu和Ser)互换，设计了多个突变体，然后以5为底物测试突变体的体外酶反应：单突变体AusE-SA获得了PrhA型“B环扩大”的功能生成12，同时保留“螺内酯形成”活性产生7(图3a)；双突变体AusE-LV/SA不再产生7、仅生成12；双突变体PrhA-VL/AS失去原来的催化活性，获得AusE型“螺内酯形成”功能且仅产生7。同时稳态酶动力学分析表明AusE-LV/SA和PrhA-VL/AS有与野生型相近的Kcat和KM值(表1)。这些结果两种加氧酶的功能完全发生改变，同时也保持了天然酶的催化效率。图3.野生型和突变型AusE和PrhA与底物5的体外酶反应a）酶促反应产物12和7被LC-MS捕捉到的离子色谱图(m/z.2)，反应时长均为5min；b）PrhA-VL/AS与底物5的体外酶反应时间梯度HPLC分析；c）PrhA-VL/AS/VM与底物5的体外酶反应时间梯度HPLC分析，以野生型AusE反应12h为对照。新峰13–16仅在PrhA-VL/AS和PrhA-VL/AS/VM而非野生型AusE的反应中出现。5在pH7.5的PIPES缓冲液中培养12h，无酶作为阴性对照。表1.AusE和PrhA的野生型和突变体的稳态动力学参数有趣的是，长时间将5与PrhA-VL/AS孵育，得到了13和14两个新产物(图3b和图4)，质谱结果显示它们分子量比7少16Da，支持13和14是7的氧化产物。为鉴定13和14的结构，研究人员通过用酶体外大反应制备分离到了13和14，其中13在无酶条件下可自发转化为14，因此基于14结构中的四氢呋喃环，推测13是7的C-13羟基化衍生物(图4)。三突变体PrhA-VL/AS/MV也催化AusE型重排反应，生成13以及另外两种产物15和16(图3c)，HRMS和NMR分析表明15为14中C1位羟基化产物(图4)。因此，PrhA双突变体能够催化额外的氧化步骤，而三突变体与野生型AusE相比，进一步氧化13至16、14至15。除了以5为底物以外，AusE也可以催化3生成4、8、9和10作为分流产物(图4)，但野生型PrhA不能以3为底物，双突变体PrhA-VL/AS可催化3得主产物8和少量的10，三突变体PrhA-VL/AS/MV几乎与野生型AusE功能相同。图4.AusE和PrhA及突变体的催化多功能三、PrhA突变体的晶体结构研究人员还获得了双突变体PrhA-VL/AS与Fe(II)、αKG与其底物(3、5、6和7)的共晶(2.25–2.3?，图5c-e)以及三突变体PrhA-VL/AS/MV与其底物3的共晶(2.35?，图5f)。分析这些晶体结构发现，Fe(II)、αKG以及八面体金属配位几何结构几乎与野生型PrhA相同。底物结合位置无显著变化，底物D环区域由相同氢键网络固定(图5a)，但A/B环区域与酶活性位点相互作用较弱，解释了酶是如何接纳底物的A/B环变化催化多步氧化的。底物D环与灵活的LoopA和有一定柔性的HairpinB(相对较高的B因子)结合，而A/B环嵌入疏水活性位点内部，其移动受到限制，因此每个底物只能有一个或两个碳上被Fe(IV)-oxo中间体攫取氢原子。Fe(II)/α-KG加氧酶的反应由底物被攫取氢原子起始。由于Fe(IV)=O的O朝向尚不清楚，所以研究人员比较各个结构中底物5反应位点(C-2和C-5)相对于Fe的距离来判断优先攫氢位点。距离特征与两种酶的第一步去饱和产物一致，并推测其中S通过H键拉动底物和影响A环构象(船式/椅式)的方式改变攫氢反应位点。接着，推导了Fe(IV)=O中间体攫氢生成自由基，并帮助脱去质子，导致形成双键或重排的机制。图5.PrhA与突变体结构叠加图a）底物在野生型PrhA和突变体中构象叠加；b-f）分别为PrhA-Fe/αKG/5(b),PrhA(VL/AS)-Fe/αKG/5(c),PrhA(VL/AS)-Fe/αKG/6(d),PrhA(VL/AS)-Fe/αKG/7(e),和PrhA(VL/AS/MV)-Fe/αKG/3(f)的活性口袋图;g）SuperimpositionoftheactivesiteofPrhA-Fe/αKG/5andPrhA(VL/AS)-Fe/αKG/5综上所述，本研究首次报道了Fe(II)/α-KG加氧酶AusE和PrhA的晶体结构，通过比较PrhA与底物5的共晶和AusE晶体结构发现了功能差异相关的三个关键催化残基，通过设计三个关键催化残基的点突变实验实现了功能互换，并得到了PrhA-VL/AS的双突变体与底物3、5、6和7的共晶以及三突变体PrhA-VL/AS/MV与底物3的共晶。本研究发现Fe(II)/α-KG加氧酶活性口袋中细微变化(三个氨基酸残基)显著影响产物的多样性，为相关生物催化剂研究提供了一个很好的范例和平台。本文共同通讯作者是日本东京大学IkuroAbe教授和日本高能物理研究所KEKToshiyaSenda教授。IkuroAbe从事天然产物发掘，生物合成及代谢工程改造研究。ToshiyaSenda从事药物靶标和生物合成酶结构生物学研究。文章信息：Nakashima,Y.,T.Mori,H.Nakamura,T.Awakawa,S.Hoshino,M.Senda,T.Senda*andI.Abe*.Structurefunctionandengineeringofmultifunctionalnon-hemeirondependentoxygenasesinfungalmeroterpenoidbiosynthesis.NatCommun9,().