前言
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OverexpressionandcharacterizationoftwotypesofnitrilehydratasesfromRhodococcusrhodochrousJ1作者是Yao、Zhang等人于年发表于PLOSPATHOGENS
Vol.1摘要
来自玫瑰色红球菌J1的腈水合酶(NHase)广泛用于丙烯酰胺和烟酰胺的工业生产。然而，来自J1的两种类型的NHase（L-NHase和H-NHase）在大肠杆菌中仅轻微表达。这限制了腈水合酶特性的全面和系统表征。我们成功地表达了两种类型的重组NHases。大肠杆菌通过密码子优化、核糖体结合位点(RBS)和间隔序列的工程设计。纯化后的L-NHase和H-NHase的比活分别为U/mg和U/mg。L-NHase和H-NHase的分子量分别为94kDa和kDa，表明两种NHase的四级结构与红球菌中的相同。H-NHase表现出比L-NHase更高的底物和产物耐受性。此外，较高的活性和更短的培养时间在重组得以实现，通过大肠杆菌和重组的全细胞催化剂。大肠杆菌相对于红球菌中的高浓度产物，携带H-NHase的耐受效率相当。玫瑰色红球菌J1代表了工业产生NHase的潜在替代品。
Vol.2图文解读
图1。本研究中使用的引物列于图1。来自红球菌的质粒pREIT19-nhlBAE，fasciansDSM被分离并用作模板克隆nhlBAE基因（GenBank：DJ.1），引物对B-up和E-down。PCR产物和载体pET24a(+)同时用NdeI-HindIII消化，将两个片段连接在一起，产生pET24a-nhlBAE。质粒pET24a-nhlBrbsAE和pET24a-nhlBrbsArbsE使用pET24a-nhlBAE作为模板构建了分别位于nhlA和nhlE前面的强RBS序列的。分别用引物对1RBS-up和1RBS-down、2RBS-up和2RBS-down进行反向PCR。为了便于纯化和分离，Strep-标签融合到质粒pET24a-nhlBrbsArbsE前面nhlB通过反向PCR引物与链球菌-B-向上和链霉素-B-下来，产生质粒pET24a-（B-链球菌）rbsArbsE。
图2：几乎所有的天然mRNA在起始密码子上游都有RBS，它在翻译起始阶段起作用。核糖体与RBS结合的效率取决于RBS与核糖体之间的互补性。天然α亚单位和NHLE的推定的RBS序列是AAACGA，其是用于在重组表达的弱RBS。增强的RBS（AAGGA）的策略涉及取代可以帮助在L-腈水合酶的异源表达.此外，起始密码子AUG和RBS之间的间隔区在调节翻译起始效率中起重要作用，影响fMet-tRNA掺入核糖体。在本研究中，我们将α-亚基mRNA的起始密码子AUG和RBS之间的间隔从63-bp减少到9-bp，这可能是增强L-NHase表达的另一个因素。这些工程的策略导致了L-腈水合酶的成功表达。
图3：
L-NHases和H-NHase表达的SDS-PAGE分析。
(A)L-NHases的表达。M：标记；1：对照，BL21(DE3)/pET24a；2：BL21(DE3)/pET24a-nhlBAE；3：BL21(DE3)/pET24a-nhlBrbsAE；4：BL21(DE3)/pET24a-nhlBrbsArbsE。(B)H-NHase的表达。M：标记；1：对照，BL21(DE3)/pET24a；2：BL21(DE3)/pET24a-nhhBAG；3：BL21(DE3)/pET24a-nhhBrbsArbsG。(C)纯化的L-NHase和H-NHase。M：标记；1、由nhlBrbsAE编码的L-NHase；2、由nhlBrbsArbsE编码的L-NHase；3、由nhhBrbsArbsG编码的H-NHase。
图4纯化蛋白质分子量的测定。
通过Superdex/GLpg柱测定NhlBA和NhhBA的分子质量和结构。标记蛋白用于凝胶过滤：（i）谷氨酸脱氢酶（酵母）（kDa），（ii）乳酸脱氢酶（猪心）（kDa），（iii）烯醇酶（酵母）（67kDa），（iv)肌激酶（酵母）（32kDa）和（v）细胞色素c（马心）（12.4kDa）。
图5酶的热稳定性、底物和产物耐受性是酶应用的重要因素。为了确定热稳定性，我们将纯化的酶在50°C下孵育60分钟，并每10分钟测量一次它们的活性。所示，L-NHase表现出比H-NHase更高的热稳定性。然而，H-NHase的底物和产物耐受性明显优于L-NHase。在1M底物（3-氰基吡啶）条件下，L-NHase的活性下降了40%，而在相同条件下对H-NHase几乎没有抑制作用。L-NHase活性在0.5M产物（烟酰胺）处理后急剧降低，相比之下，H-NHase在1.5M烟酰胺处理后仍有60%的活性。H-NHase可能更适合工业应用，因为它具有更高的产品耐受性，这会导致高产品浓度。
Vol.3总结与展望
无论是固定化细胞还是游离NHase，在生物转化过程的后期，酶都应暴露于具有高浓度产物的环境中。对高浓度产品的耐受性是NHase在工业应用中必须具备的基本特性。尽管携带L-NHase的重组大肠杆菌的产品耐受性低于玫瑰色红球菌J1。但携带H-NHase的重组大肠杆菌与J1相比，大肠杆菌显示出相同的产品耐受性。在重组的低活性大肠杆菌可以通过高密度发酵增加生物质的数量来消除含有H-NHase的大肠杆菌。此外，蛋白质工程可以增强NHase的产品耐受能力。最著名的策略是将自组装肽融合到NHase的N端，这可以大大增强对高浓度产品的耐受能力。
Vol.4文献链接