所谓单酶切法，即在基因工程中使用同种限制性内切核酸酶（限制酶）切割目的基因和质粒，然后用DNA连接酶连接，以获得所需要的重组质粒的方法。
所谓双酶切法，即在基因工程中使用2种限制酶分别切割目的基因的两端，同时用上述2种限制酶切割质粒，然后用DNA连接酶连接，以获得所需要重组质粒的方法。
1问题的提出
基因工程单酶切法和双酶切法，近年高考屡有涉及，首先看看近年来都考了什么。
年海南高考生物学第26题第1小题：
将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRⅠ酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由2个DNA片段之间连接形成的产物有：载体-载体连接物、目的基因-载体连接物、目的基因-目的基因连接物3种。
年江苏高考生物学第34题第2小题：图中②表示HindⅢ与BamHⅠ酶切、DNA连接酶连接的过程，此过程可获得2种重组质粒；如果换用BstⅠ与BamHⅠ酶切，目的基因与质粒连接后可获得1种重组质粒。
年江苏高考生物学第27题第4小题：与只使用EcoRI相比较，使用BamHI和HindIII2种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化。
年海南高考就涉及单酶切法有关情况，江苏年高考和年高考都涉及单酶切法与双酶切法的比较，以及双酶切法的优点。
双酶切法比单酶切法究竞有何优势？仅仅如高考题答案所说的那样吗？
下面讨论2种酶切方法的区别。
2问题探讨
2.1单酶切法
假设目的基因的两侧各有1个EcoRI限制酶识别位点，质粒上也有1个EcoRI限制酶识别位点，假设用EcoRI限制酶处理之后，所有的识别位点都被切割开来，产生相同的黏性末端，这些黏性末端被DNA连接酶连接，如果除去未能环化和3个及3个以上片段连接形成的DNA片段不谈，仅讨论单个片段和2个片段环化的情况,那么就会出现以下5种环：
除去前2种是自身环化的情况，后3种就是年海南高考生物学第26题所说的3种情况。按理说即使包括未能环化和3个及3个以上片段连接形成的DNA片段，由于这些片段大小不同，利用电泳技术应该很容易分开，从而得到目的基因和质粒组成的重组质粒。
但以上理解忽略了一个情况，即DNA是有方向的，DNA2条链的核苷酸序列不同，所携带的遗传信息也不同。
利用箭头标记来显示DNA的方向,按上述条件，则应该会出现下面8种情况：
除了单个目的基因和质粒自身环化的情况，其他3种情况都是两两大小相同，连接方向相反的。故年海南高考生物学第26题中由2个DNA片段之间连接形成的载体－载体连接物、目的基因－载体连接物、目的基因－目的基因连接物3种产物。每种产物其实都包含同向连接和反向连接2种情况。然而，由于题目所问的只是什么和什么相连的问题，并没有考虑同向连接和反向连接的问题，所以不能说答案错误。
年江苏高考生物学第34题中，虽然没有考单酶切法，但所考第2种情况（如果换用BstI与BamHI酶切，目的基因与质粒连接后可获得1种重组质粒），因为BstI与BamHI酶切序列相同，产生的黏性末端碱基可互补配对，可用DNA连接酶连接，所以相当于单酶切法。因为目的基因和质粒相连包括同向连接和反向连接2种情况，所以，实际可形成2种重组质粒，而不是答案的1种。
单酶切法形成的连接产物种类较多，可以用电泳等方法先加以纯化，减少后续操作的工作量。但并不易将需要的重组质粒和与它大小相同连接方向相反的重组质粒分离。
2.2双酶切法
为便于区分，用黏性末端和平末端来分别表示2种限制酶切割的效果。除去未连接的DNA片段和3个及3个以上片段连接形成的DNA片段不谈，仅讨论单个片段和2个片段环化的情况,会出现以下5种环：
由图示可知，每个片段两端的末端都不同，没有单个目的基因和单个质粒片段的自身环化，也不可能出现连接方向相反的情况，因此也没有与需要的重组质粒大小相同的其他片段，为重组质粒的提取纯化创造了条件。
当然在实验操作中，用限制酶处理质粒与目的基因后，要经过酶切产物的纯化，如通过电泳等方法去除不需要的DNA片段（如酶切后产生的质粒短片段），再进行连接。实际产生的重组产物就更少了，也可减少后续的工作量。
所以年江苏高考生物学第27题中与只使用EcoRI相比较，使用BamHI和Hind川2种限制酶同时处理质粒、外源DNA后产生的黏性末端的碱基不能互补配对，所以除了可以防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化外，更重要的是没有连接方向相反的情况，也就没有与需要的重组质粒大小相同的其他片段，更有利于重组质粒的提取纯化。
3总结
综上所述，可以得出结论：单酶切法得到的片段中,有需要的重组质粒，还有很多不需要的DNA片段，其中有的片段与需要的片段大小相同，连接方向相反，从而导致难以去除，给后续操作带来更多的麻烦；双酶切法得到的片段中，有需要的重组质粒，也有不需要的DNA片段，但片段的种类较少，没有自身环化的片段，也没有与所需的片段重组质粒大小相同连接方向相反的片段，所以更容易利用电泳技术将其分离开来。
总之双酶切和单酶切比较，优点在于：1）防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化；2）避免目的基因反向连接的情况；3）连接后的片段种类减少，降低筛选难度，这才是双酶切法优于单酶切法的根本之处。
4延伸
不管是单酶切法还是双酶切法，其实都可以直接将各种片段转入受体细胞，然后再通过后期检测来选择，但是这样做既浪费人力物力，而且成功率低，甚至失败。
当然，单酶切法也有其优点，即操作简单；双酶切法也有其缺点，即需使用2种酶切割，由于每种限制酶作用的条件不同，一般2种酶不能同时使用，而是一种酶处理之后，更换外界条件再处理另一种酶，以保证酶的高效性，因此操作较复杂，且酶切成功率也相对较低一些。
不同的学者在基因工程研究中虽然采用的原理相同，但具体的实验细节和流程是有所差异的，所以单一说某种方法好，某种方法不好，是片面的。应以发展的眼光看问题，因为科学技术本来就是不断发展的。
注：转自《生物学通报》
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