大家好，今天为大家分享一篇年发表在Angew.Chem.Int.Ed.上的文章，题目为“UltrafastElectrothermalFlow-EnhancedMagnetoBiosensorforHighlySensitiveProteinDetectioninWholeBlood”，本文设计了一个简单的电热流增强生物传感器，并将其用于全血中蛋白质生物标志物的检测，从而实现了对其超快，高灵敏度的检测。通讯作者是来自莱斯大学的PeterB.Lillehoj教授，PeterB.Lillehoj教授主要从事微流控和BioMEMS技术的开发与转化方面的研究。
背景介绍
蛋白生物标志物的检测已被广泛应用于临床，如医学筛查，疾病诊断等。目前，对生物体液中蛋白质生物标志物进行灵敏、定量检测最常见的实验室技术是酶联免疫吸附试验(ELISA)，它被认为是临床的金标准，但该技术需要样品纯化、多次洗涤步骤和长时间的孵育，妨碍了它们用于快速检测，因此，亟需开发新型检测蛋白的方法。
设计思路
将丝网印刷金电极（SPGE）装置置于聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）密闭容器内，将金电极（WE）表面修饰anti-PfHRP2IgM,对血液样品中双标记磁性纳米粒子（DMB）进行检测。DMBs表面修饰辣根过氧化物酶（HRP）及与HRP共轭的anti-PfHRP2IgG，当靶蛋白存在时，靶蛋白与DMB表面修饰抗体特异性结合，形成抗原-DMB复合物。当对电极施加电压时，电热流（ACEF）的加入会促进抗原-DMB免疫复合物的形成（图1A）。在施加电压的情况下，将磁铁置于传感器下方，产生局部磁场，抗原-DMB免疫复合物迅速迁移到传感器表面，与WE上的捕获抗体结合（图1B）。当溶液中存在TMB时，DMB上的HRP催化过氧化氢对TMB的氧化反应，施加电压后，氧化的TMB发生还原反应，电流信号发生改变（图1C），从而实现对靶蛋白的快速检测。
图1.实验原理图数据介绍
由于全血成分复杂，其基质效应易影响传感器的性能，因此，作者首先在不同稀释倍数（0×、2×、5×、20×）的分别加入0ng/mL和1ng/mL的PfHRP2（恶性疟原虫富含组氨酸蛋白），探究了血液稀释倍数对免疫传感器性能的影响（图2A），结果发现，样品稀释倍数越高，其ΔI值越大，说明稀释可显著降低血液基质效应。随后，作者通过对5个献血者进行不同稀释因子的加标血样进行测量（图2B），探究了血液稀释对免疫传感器可靠性的影响。结果发现，血样稀释5倍和20倍时，样本ΔI值趋于稳定，由于过度稀释易降低检测灵敏度，因此，后续检测作者采用了5×稀释因子。图2.全血稀释倍数对传感器性能的影响
接下来，作者探究了加样体积对电热流特性的影响，结果发现，样品体积越大，电热流流速越快（图3A）。随后，作者利用该传感器对含有PfHRP2的不同体积血液样本进行了检测，结果发现，加样体积为80μL时ΔI值最大（图3B），因此，作者后续实验加样体积选为80μL。为可视化ACEF诱导的流体运动，作者将红色微珠用作示踪粒子，将其加到SPGE传感器中，结果如图3C所示，在ACEF作用下，微珠迅速混匀，进一步说明ACEF可促进双标记DMB与抗原间的反应。随后，作者探究了电压及通电时间对传感器性能的影响(图3D），结果发现在电压为25V,通电时间为5min时，其性能最佳，且该条件下，液滴温度为31.2℃（图2E），对样品无影响。
图3.传感器条件优化
最后，作者对ACEF增强免疫传感器的性能进行了探究，作者首先探究了不同信号增强方法传感器的性能（图4A），结果发现，在存在磁选（MC）和ACEF情况下，传感器性能最佳。随后，作者利用该传感器对不同浓度的PfHRP2进行了检测，发现该传感器在为0~pg/mLPfHRP2浓度范围内呈良好的线性关系（图4B,C），其最低检出限为5.7pg/mL。为了评估这种免疫传感器的准确性，作者将该传感器与商用超灵敏PfHRP2ELISA试剂盒对疟疾患者临床血液样本（P1-P8）和健康人的血液样本（N1-N6）进行了检测，结果发现两种方法具有良好的相关性（图4D），6个未感染供体样本（N1-N6）的安培信号和吸光度值均低于两种检测方法的临界值（图4E），表明两种方法都能够准确识别阴性病例，但对于阳性样本，ELISA试剂盒仅可检测出5个阳性，而免疫传感器可准确识别全部阳性样本，表明该方法具有更高的准确性。
图4.传感器性能的研究
总结
作者开发了一种新型电热流增强生物传感器，该传感器主要通过将ACEF与电化学磁免疫分析法相结合，从而实现对全血中蛋白质生物标志物的高灵敏度检测，该方法在快速诊断测试领域具有广阔的应用前景。
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