核酸体外扩增是分子生物学研究的基础。随着生物技术的发展,出现了越来越多的核酸体外扩增技术。根据其特点可分为三类:一类是靶核酸的直接扩增,如聚合酶链式反应等;一类是探针扩增技术，如Cleavase/InvaderTechnology；另一类是信号放大扩增,如HC2。本推送主要介绍靶核酸的直接扩增技术，全文主要翻译自23版的Herry实验室临床诊断及管理。
PCR
聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction:PCR），是一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段。PCR由凯利·穆利斯发明，并于年获诺贝尔化学奖。但PCR只能复制很短的DNA片段，通常不超过10kbp，但对于大多数IVD应用，这个长度已经足够。其基本原理是在热循环下分别进行变性、退火和延伸，目的是完成DNA双链的解离、引物与模板DNA的结合，最终在DNA聚合酶的作用下延伸DNA子链。在经过N个循环后，目标DNA就完成了指数级扩增。
目前应用的聚合酶链式反应需要几个基本组成：
DNA模板（template），含有需要扩增的DNA片段。
2个引物（primer），决定了需要扩增的起始和终止位置。
DNA聚合酶（polymerase），复制需要扩增的区域，其中最经典就是Taq酶，来自于水生栖热菌。
脱氧核苷三磷酸（dNTP），用于构造新的互补链。
含有镁离子的缓冲体系，提供适合聚合酶行使功能的化学环境。
聚合酶链式反应在热循环设备中进行。PCR仪可以将反应管加热或冷却到每步反应所需的精确的温度。为防止反应体系中液体产生蒸气，通常在反应管上加盖加热的盖子（比加热板温度来的高），或者在反应体系表面加入一层石蜡油。
逆转录PCR（RT-PCR）
PCR利用DNA聚合酶和热循环完成了DNA的体外复制，但无法实现RNA的扩增。RT-PCR就是为了改善这一缺陷。通常，在RT-PCR中，首先使用逆转录酶将RNA模板转化为互补DNA（cDNA）。然后将cDNA用作使用PCR进行指数扩增的模板。其中逆转录酶通常使用不耐热的禽成纤维细胞病病*逆转录酶（AMV-RT），DNA聚合酶和PCR一样。当然，现在也存在单一酶的RT-PCR。
RT-PCR的难点在于RNA存在二级或三级结构，可能需要特殊条件或其他靶位点才能有效合成cDNA。目前常用的实验方案有一步法和两步法。一步法从cDNA合成到PCR扩增的整个反应都在单个试管中进行，通过把逆转录酶和DNA聚合酶一次性加入到反应管中，最大程度地减少实验差异。两步法需要在单独的试管中进行逆转录酶反应和PCR扩增，尽管增加了反应步骤加大了污染的可能性，但准确性和灵敏度更高，对RNA模板保护更好。
巢式PCR
由于常规PCR只使用2个引物，其决定了需要扩增的起始和终止位置，为了减少由于未预期的引物结合位点的扩增而导致产物中的非特异性结合，巢式PCR（NestedPCR）被开发出来。巢式PCR涉及两组引物，用于连续两次进行的聚合酶链反应，第二组引物用于扩增第一批产物中的第二个靶标。这样可以在第一轮扩增时进行少量扩增，从而限制了非特异性产物。第二套嵌套引物只能从第一轮扩增中扩增出目标产物，而不是非特异性产物。这样可以运行更多的总周期，同时最大程度地减少非特定产品。这对于稀有模板或具有高背景的PCR很有用。
巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。巢式PCR比较经典的例子是FilmArray的微流控分子诊断系统，在之后的微流控呼吸道疾病诊断会进行详细分析。
多重PCR
多重PCR本质上和PCR类似，只是为了一次性完成多种靶标的扩增，在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。由于PCR使用的酶都一样，所以多重PCR只需要对引物进行设计。多重PCR最大的难点就在于必须优化所有引物的设计，以便所有引物在同一温度循环下都能够正常工作。
实时荧光定量PCR（q-PCR）
前面介绍的多种分子扩增技术基本都基于凯利·穆利斯PCR体系的改进，而实时荧光定量PCR算是新一代的PCR技术。实时荧光定量PCR可以在PCR期间（即real-time）监控目标DNA分子的扩增，而不是像常规PCR一样在末端监测（end-point）。很多人把实时荧光定量PCR的缩写为RT-PCR，但标准的写法是q-PCR，RT-PCR是逆转录PCR。
q-PCR根据荧光的来源可分为染料法和荧光探针法。染料法使用DNA结合染料，其能够与所有双链（ds）DNA结合，从而增加了染料的荧光量子产率。因此，PCR期间DNA产物的增加导致每个循环中测得的荧光强度增加。但是，dsDNA染料（例如SYBRGreen）将与所有dsDNAPCR产物结合，包括非特异性PCR产物（例如Primer二聚体）。这可能会干扰或阻止对目标靶序列的准确监控。
荧光探针法仅检测含有与该探针互补的DNA，可有效增加特异性，该方法依赖于荧光标记的DNA探针，该探针的一端具有荧光报告基因，而在探针的另一端具有荧光猝灭剂。报告分子与淬灭剂非常接近，由于荧光共振而无法检测到荧光。Taq聚合酶的5到3核酸外切酶活性导致的探针断裂破坏了报告基因与猝灭剂的邻近性，因此允许荧光的非猝灭发射，可以在用激光激发后进行检测。
目前，同样的理念可用于开发实时荧光RT-PCR。通过添加多种引物，可开发实时荧光多重PCR。
数字PCR
数字PCR即DigitalPCR（dPCR)，是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR能够直接读出DNA分子的个数，是对起始样品核酸分子的绝对定量。目前dPCR主要有两种形式，芯片式和液滴式，但基本原理都是将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。详细的介绍可查看之前的推送。
TMA
前面介绍的PCR系统都需要在反应过程中对温度进行控制，反应时间往往决定于热循环的速度。转录介导扩增TMA是一种等温的核酸扩增系统，由Gen-Probe公司研发，于年8月被Hologic收购。TMA利用RNA聚合酶和逆转录酶，以RNA为模板在约42oC等温反应条件下进行扩增，产物为RNA。该技术在每一循环可产生模板的-0个拷贝转录本。
转录介导等温核酸扩增是针对靶序列设计一对特异性引物，其中启动子引物（Promoterprimer）上具有T7RNA聚合酶识别的启动子序列，这一引物与靶序列结合后，在反转录酶的作用下进行反转录反应，形成RNA/DNA杂交分子。反转录酶所具有的RNaseH活性可以水解RNA/DNA杂交分子，形成单链NDA，该单链DNA含有T7RNA聚合酶识别的启动子序列。然后引物2与单链DNA结合，通过反转录合成双链DNA。T7RNA聚合酶结合在启动子上，以DNA为模板进行转录，由一分子DNA模板可得到-0拷贝转录本，这些转录本又进入反应，作为转录介导等温核酸扩增的起始模板，重复上述步骤。
NASBA
基于核酸序列的扩增NASBA是另一种基于转录（Transcription-basedamplification）的核酸扩增技术。NASBA由JCompton在年开发，其技术原理和TMA类似，因此很多技术文章把它们都放到一起讨论。
环介导等温扩增技术LAMP
LAMP是另一种等温扩增技术，其温度相对于TMA和NASBA高（60-65度）。LAMP法的特征是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应。LAMP最大的优点是操作简单，且灵敏度和特异性也高，结果可通过肉眼观察白色沉淀或者检测绿色荧光判断，常用于开发POCT系统。
但LAMP的通用性不如PCR，且多路复用性差。引物设计是LAMP的一个难点，且受到众多限制，常常依赖于自由，开源或商业软件用于协助LAMP引物设计。
解旋酶依赖性扩增HDA
HAD是一种等温扩增技术，其由BioHelix开发。首先，双链DNA被DNA解旋酶分开，并被单链DNA（ssDNA）结合蛋白包被。在第二步中，两个序列特异性引物与DNA模板的每个边界杂交。然后使用DNA聚合酶将退火的引物延伸至模板，以产生双链DNA，然后将两种新合成的DNA产物用作DNA解旋酶的底物，进入下一轮反应。
HDA的优点在于，它提供了在不需要热循环仪的等温温度下对特定靶标进行核酸扩增的快速方法。但是，研究人员需要事先优化引物和缓冲液。
其它等温扩增方法还有NickingEnzymeAmplificationReaction(NEAR)、Rollingcircleamplification（RCA）、Re